WO2010079076A2 - Autosomal dominante polyzystische nierenerkrankung (adpkd) - Google Patents

Autosomal dominante polyzystische nierenerkrankung (adpkd) Download PDF

Info

Publication number
WO2010079076A2
WO2010079076A2 PCT/EP2009/067430 EP2009067430W WO2010079076A2 WO 2010079076 A2 WO2010079076 A2 WO 2010079076A2 EP 2009067430 W EP2009067430 W EP 2009067430W WO 2010079076 A2 WO2010079076 A2 WO 2010079076A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
markers
polypeptide
absence
amplitude
adpkd
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/067430
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2010079076A3 (de
Inventor
Harald Mischak
Original Assignee
Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag filed Critical Mosaiques Diagnostics And Therapeutics Ag
Priority to EP09796710A priority Critical patent/EP2394171A2/de
Priority to US13/140,106 priority patent/US20110297543A1/en
Publication of WO2010079076A2 publication Critical patent/WO2010079076A2/de
Publication of WO2010079076A3 publication Critical patent/WO2010079076A3/de
Priority to US14/575,582 priority patent/US20150346150A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • ADPKD Autosomal dominant polycystic kidney disease
  • the present invention relates to a method and apparatus for diagnosing autosomal dominant polycystic kidney disease.
  • ADPKD Autosomal dominant Polycystic Kidney Disease
  • cysts are a complex process that is phenotypically similar to dedifferentiation, including high proliferation rates, increased apoptosis, altered protein sorting, altered secretory properties, and disorganization of the extracellular matrix.
  • kidney-type cysts are the most significant symptom
  • cyst formation also occurs outside the kidneys, especially in the liver (occasionally to the point of polycystic liver disease) and increased frequency of other disorders such as intercranial aneurysms. This shows that ADPKD is a systemic disease.
  • ADPKD is the most common life-threatening hereditary disease. The incidence of ADPKD is greater than that of HD, hemophilia, sickle cell anemia, cystic fibrosis, myotonic dystrophy, and Down syndrome combined.
  • ADPKD Alzheimer's disease
  • the gene for PKD-I has been located on chromosome 16 and is associated with polycystin-1 protein, which is mutated in approximately 85% of all patients with ADPKD.
  • the gene for PKD-2 located on chromosome 4 mutates in 15% of ADPKD cases and is associated with polycystin-2 protein.
  • Object of the present invention was to provide a way of diagnosing ADPKD available.
  • the problem is solved by a method for Diagnostic as claim 1 of an autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) comprising the step of determining the presence or absence or amplitude of at least three polypeptide markers in a urine sample, wherein the polypeptide markers are selected from the markers shown in Table 1 by values for molecular masses and the Mi rationszeit are characterized.
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • This method can also be used for early diagnosis and prognosis of further disease development.
  • At least five, at least six, at least eight, at least ten, at least 20 or at least 50 polypeptide markers be used, as defined in Table 1.
  • the urine sample is a midbeam urine sample.
  • the use of a human urine sample is preferred.
  • the measurement of the amplitudes and / or presence or absence can be done by a variety of methods. Suitable methods include capillary electrophoresis, HPLC, gas phase ion spectrometry and / or mass spectrometry.
  • capillary electrophoresis is performed prior to measuring the molecular mass of the polypeptide markers.
  • Mass spectrometry is particularly useful for measuring the amplitude or the presence or absence of the polypeptide marker (s).
  • the method preferably has a sensitivity of at least 60% and a specificity of at least 60%.
  • the sensitivity is at least 70% or at least 80% and the specificity is at least 70% or at least 80%.
  • the sample is initially separated into at least three, preferably at least 5 or 10 subsamples. Subsequently, an analysis of at least three, preferably at least 5 or 10 subsamples to determine a presence or absence or amplitude of at least one polypeptide marker in the sample, wherein the polypeptide marker is selected from the markers of Table 1, which by the molecular masses and migration time (CE Time) are characterized.
  • CE times given in the tables are based on a 90 cm long glass capillary with an internal diameter (ID) of 50 ⁇ m at an applied voltage of 25 kV, using as eluant 20% acetonitrile, 0.25% formic acid in water , Details are included in the experimental section.
  • Specificity is defined as the number of actual negative samples divided by the sum of the number of actual negatives and the number of false positives. A specificity of 100% means that a test identifies all healthy persons as healthy, ie no healthy person is identified as ill. This does not say anything about how well the test detects sick patients. Sensitivity is defined as the number of actual positive samples divided by the sum of the number of actual positives and the number of false negatives. A sensitivity of 100% means that the test detects all patients. He does not say how well the test detects healthy people.
  • the markers according to the invention make it possible to achieve a specificity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95%, for the indicated disease for which a diagnosis is desired.
  • the markers of the invention make it possible to achieve a sensitivity of at least 60, preferably at least 70, more preferably 80, even more preferably at least 90 and most preferably at least 95% for the indicated disease for which a diagnosis is desired.
  • the migration time is determined by capillary electrophoresis (CE) - e.g. in example under point 2 - determined.
  • CE capillary electrophoresis
  • a 90 cm long glass capillary with an inner diameter (ID) of 50 ⁇ m and an outer diameter (OD) of 360 ⁇ m is operated at an applied voltage of 30 kV.
  • eluent for example, 30% methanol, 0.5% formic acid in water can be used.
  • CE migration time can vary. Nevertheless, the order in which the polypeptide labels elute is typically the same for each CE system used under the conditions indicated. To even out any differences in migration time, the system can be normalized using standards for which migration times are known. These standards may e.g. the polypeptides given in the examples (see examples).
  • CE-MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • polypeptide markers according to the invention are proteins or peptides or degradation products of proteins or peptides. They may be chemically modified, eg by post-translational modifications such as glycolization, phosphorylation, alkylation or disulfide bridging, or altered by other reactions, eg in the context of degradation. In addition, the Polypeptide marker also chemically modified during the purification of the samples, for example, oxidized, be.
  • polypeptide markers molecular mass and migration time
  • polypeptides of the invention are used to diagnose ADPKD.
  • Diagnosis is the process of gaining knowledge by assigning symptoms or phenomena to a disease or injury.
  • the presence or absence of certain polypeptide markers is also used differential diagnosis.
  • the presence or absence of a polypeptide marker can be measured by any method known in the art. Methods that can be used are exemplified below.
  • a polypeptide marker is present when its reading is at least as high as the threshold. If its reading is below that, the polypeptide marker is absent.
  • the threshold value can either be determined by the sensitivity of the measurement method (detection limit) or defined based on experience.
  • the threshold is preferably exceeded when the sample reading for a given molecular mass is at least twice that of a blank (e.g., only buffer or solvent).
  • the polypeptide marker (s) is / are used to measure its presence or absence, the presence or absence being indicative of ADPKD.
  • polypeptide markers which are typically present in individuals with ADPKD, but are less common or non-existent in individuals without ADPKD.
  • polypeptide markers that are present in patients with ADPKD but are not or only rarely present in patients without ADPKD.
  • amplitude markers can also be used for diagnosis.
  • Amplitude markers are used in a manner that does not determine the presence or absence, but decides the magnitude of the signal (amplitude) in the presence of the signal in both groups.
  • the tables show the mean amplitudes of the corresponding signals (characterized by mass and migration time) over all measured samples. Two nomination procedures are possible to achieve comparability between differently concentrated samples or different measurement methods. In the first approach, all peptide signals of a sample are normalized to a total amplitude of 1 million counts. The respective mean amplitudes of the single markers are therefore given as parts per million (ppm).
  • All groups used consist of at least 20 individual patients or control samples to obtain a reliable mean amplitude.
  • the decision to make a diagnosis depends on how high the amplitude of the respective polypeptide markers in the patient sample is compared to the mean amplitudes in the control group or the "sick" group. If the value is close to the mean amplitude of the "sick" group, it can be assumed that the presence of ADPKD is more in line with the mean amplitudes of the control group and is not based on ADPKD.
  • the distance to the mean amplitude can be interpreted as a probability of belonging to a group.
  • the distance between the measured value and the mean amplitude may be considered as a probability of belonging to a group.
  • a frequency marker is a variant of the amplitude marker, in which the amplitude is low in some samples. It is possible to convert such frequency markers into amplitude markers in which, in the calculation of the amplitude, the corresponding samples in which the marker is not found, with a very small amplitude - in the range of the detection limit - are included in the calculation.
  • the individual from whom the sample is derived, in which the presence or absence of one or more polypeptide markers is determined can be any individual who may suffer from ADPKD.
  • the subject is a mammal, most preferably a human.
  • not only three polypeptide markers but a larger combination of markers are used to facilitate differential diagnostics.
  • the falsification of the overall result can be reduced or avoided by individual individual deviations from the typical probability of presence in the individual.
  • the sample measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) of the invention may be any sample recovered from the subject's body.
  • the sample is a sample having a polypeptide composition suitable for making statements about the condition of the individual.
  • it may be blood, urine, synovial fluid, tissue fluid, body secretions, sweat, cerebrospinal fluid, lymph, intestinal, gastric, pancreatic, bile, tears, tissue, sperm, vaginal fluid, or a stool sample.
  • it is a liquid sample.
  • the sample is a urine sample.
  • Urine samples may be known as known in the art.
  • a mid-jet urine sample is used.
  • the urine sample may e.g. by means of a catheter or also with the aid of a urination apparatus, as described in WO 01/74275.
  • the presence or absence of a polypeptide marker in the sample can be determined by any method known in the art suitable for measuring polypeptide markers. Those skilled in such methods are known. In principle, the presence or absence of a polypeptide marker can be determined by direct methods such as e.g. Mass spectrometry, or indirect methods, e.g. by ligands.
  • the sample of the individual e.g. the urine sample
  • pretreated prior to measuring the presence or absence of the polypeptide marker (s) by any suitable means e.g. be cleaned or separated.
  • the treatment may e.g. a purification, separation, dilution or concentration.
  • the methods may be, for example, centrifugation, filtration, ultrafiltration, dialysis, precipitation or chromatographic methods such as affinity separation or separation by means of ion exchange chromatography, or an electrophoretic separation.
  • the sample is separated by electrophoresis prior to its measurement, purified by ultracentrifugation and / or separated by ultrafiltration into fractions containing polypeptide labels of a specific molecular size.
  • a mass spectrometric method is used to determine the presence or absence of a polypeptide marker, which method may precede purification or separation of the sample.
  • the mass spectrometric analysis has the advantage over current methods that the concentration of many (> 100) polypeptides of a sample can be determined by a single analysis. Any type of mass spectrometer can be used. With mass spectrometry, it is possible to routinely measure 10 fmoles of a polypeptide marker, that is, 0.1 ng of a 10 kDa protein with a measurement accuracy of approximately ⁇ 0.01% from a complex mixture. For mass spectrometers, an ionic forming unit coupled with a suitable analyzer.
  • electrospray ionization (ESI) interfaces are most commonly used to measure ions from liquid samples, whereas the matrix assisted laser desorption / ionization (MALDI) technique is used to measure ions from sample crystallized with a matrix.
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization
  • quadrupoles, ion traps or time-of-flight (TOF) analyzers can be used to analyze the resulting ions.
  • electrospray ionization the molecules present in solution i.a. under the influence of high voltage (e.g., 1-8 kV) to form charged droplets which become smaller by evaporation of the solvent.
  • high voltage e.g. 1-8 kV
  • Coulomb explosions lead to the formation of free ions, which can then be analyzed and detected.
  • TOF analyzers have a very high scanning speed and achieve a very high resolution.
  • Preferred methods for determining the presence or absence of polypeptide markers include gas phase ion spectrometry, such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • gas phase ion spectrometry such as laser desorption / ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surface enhanced laser desorption ionization), LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry), 2D-PAGE-MS and capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). All of the methods mentioned are known to the person skilled in the art.
  • CE-MS in which capillary electrophoresis is coupled with mass spectrometry. This process is described in detail, for example, in German patent application DE 10021737, in Kaiser et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, Vol. 1013: 157-171, and Electrophoresis, 2004, 25: 2044-2055) and in Wittke et al. (J. Chromatogr. A 1 2003, 1013: 173-181).
  • the CE-MS technique allows to determine the presence of several hundreds of polypeptide markers of a sample simultaneously in a short time, a small volume and high sensitivity. After a sample has been measured, a pattern of the measured polypeptide markers is prepared. This can be compared with reference patterns of ill or healthy individuals. In most cases it is sufficient to use a limited number of polypeptide markers for the diagnosis of UAS. More preferred is a CE-MS method which includes CE coupled online to an ESI-TOF-MS.
  • the use of volatile solvents is preferred, and it is best to work under essentially salt-free conditions.
  • suitable solvents include acetonitrile, methanol and the like.
  • the solvents may be diluted with water and an acid (eg 0.1% to 1% formic acid) added to protonate the analyte, preferably the polypeptides.
  • an acid eg 0.1% to 1% formic acid
  • Capillary electrophoresis makes it possible to separate molecules according to their charge and size. Neutral particles migrate at the rate of electroosmotic flow upon application of a current, cations are accelerated to the cathode and anions are retarded.
  • capillaries in electrophoresis is the favorable ratio of surface area to volume, which enables a good removal of the Joule heat arising during the current flow. This in turn allows the application of high voltages (usually up to 30 kV) and thus a high separation efficiency and short analysis times.
  • quartz glass capillaries with internal diameters of typically 50 to 75 ⁇ m are normally used. The used lengths are 30-100 cm.
  • the capillaries usually consist of plastic-coated quartz glass.
  • the capillaries may be both untreated, i. on the inside show their hydrophilic groups, as well as be coated on the inside. A hydrophobic coating can be used to improve the resolution.
  • a pressure which is typically in the range of 0-1 psi may also be applied. The pressure can also be created during the separation or changed during the process.
  • the markers of the sample are separated by capillary electrophoresis, then directly ionized and transferred online to a mass spectrometer coupled thereto for detection.
  • polypeptide markers can advantageously be used for diagnostics.
  • Figure 1 shows the summed data from urine samples from control patients and ADPKD patients.
  • FIG. 2 shows the receiver operating characteristic curves for the training and the test set.
  • Urine was used to detect polypeptide markers for diagnosis. Urine was given by healthy donors (peer group), patients undergoing chronic kidney disease or renal or bladder carcinoma ("disease control") as well as patients suffering from ADPKD.
  • proteins such as albumin and immunoglobulins, which are also present in urine of patients in higher concentrations, had to be separated by ultrafiltration.
  • 700 .mu.l of urine were removed and treated with 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • 700 .mu.l filtration buffer (2M urea, 1OmM ammonia, 0.02% SDS).
  • sample volumes were ultrafiltered (20 kDa, Sartorius, Gottingen, DE).
  • the UF was carried out at 3000 rpm in a centrifuge until 1.1 ml ultrafiltrate was obtained.
  • CE-MS measurements were performed using a Beckman Coulter capillary electrophoresis system (P / ACE MDQ System, Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) and Bruker ESI-TOF mass spectrometer (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).
  • the CE capillaries were purchased from Beckman Coulter, having an ID / OD of 50/360 ⁇ m and a length of 90 cm.
  • the mobile phase for the CE separation consisted of 20% acetonitrile and 0.25% formic acid in water. 30% isopropanol with 0.5% formic acid was used for the "sheath flow" on the MS, here with a flow rate of 2 ⁇ l / min.
  • the coupling of CE and MS was performed by a CE-ESI-MS sprayer kit (Agilent Technologies , Waldbronn, DE).
  • the duration of the injection was 99 seconds. With these parameters about 150 nl of the sample were injected into the capillary, this corresponds to about 10% of the capillary volume.
  • a "stacking" technique was used, injecting an IM NH 3 solution for 7 sec (at 1 psi) before injecting the sample and injecting a 2M formic acid solution for 5 sec after sample injection the separation voltage (30 kV), the analytes are automatically concentrated between these solutions.
  • the following CE separation was performed with a pressure method: 0 psi for 40 minutes, 0.1 psi for 2 minutes, 0.2 psi for 2 minutes, 0.3 psi for 2 minutes, 0.4 psi for 2 minutes, finally 17 min at 0.5 psi.
  • the total duration of a separation run was thus 65 minutes.
  • the "Nebulizer gas" was set to the lowest possible value.
  • the voltage applied to the spray needle to generate the electrospray was 3700 - 4100 V.
  • the remaining settings on the mass spectrometer were optimized according to the manufacturer's instructions for peptide detection.
  • the spectra were recorded over a mass range of m / z 400 to m / z 3000 and accumulated every 3 seconds. 3.
  • ELM sequence: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.49 min
  • the proteins / polypeptides are each used in a concentration of 10 pmol / ⁇ l in water.
  • REV "REV”, "ELM”, “KINCON” and “GIVLY” represent synthetic peptides.
  • the most probable assignment is that in which there is a substantially linear relationship between the shift for the peptide 1 and for the peptide 2.
  • the 75 biomarkers already showed an AUC of 0.89, so they are excellently suited.

Abstract

Das Verfahren zur Diagnostik einer autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.

Description

Autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankunq (ADPKD)
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Diagnose von autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung.
Autosomale-dominant polyzystische Nierenerkrankung (Autosomal-Dominant- Polycistic Kidney Disease, ADPKD) ist eine der häufigsten humanen monogenetischen Erkrankungen mit einer Häufigkeit zwischen 1 :400 bis 1 : 1.000. Die Krankheit zeigt eine fortschreitende Entwicklung und Vergrößerung von flüssigkeitsgefüllten Vesikeln bzw. Bläschen in beiden Nieren, die die Funktionsfähigkeit der Nieren erheblich einschränkt. Bis zum 60. Lebensjahr werden ca. 50% der betroffenen Er- krankten dialysepflichtig.
Die Entwicklung der Zysten ist ein komplexer Vorgang, der phänotypisch einer Dedifferenzierung gleicht unter anderem mit hohen Proliferationsraten, erhöhter Apoptose, veränderter Proteinsortierung, geänderten sekretorischen Eigenschaften und einer Disorganisation der extrazellulären Matrix. Obwohl die in der Niere auftretenden Zysten das signifikanteste Symptom darstellen, treten bei den Patienten auch Zystenbildungen außerhalb der Nieren auf, insbesondere in der Leber (gelegentlich bis hin zu den Symptomen der polyzystischen Lebererkrankung) sowie eine erhöhte Häufigkeit von anderen Störungen wie intercranialen Aneurysmen. Dies zeigt, dass ADPKD eine systemische Erkrankung ist.
ADPKD ist die häufigste lebensbedrohliche Erbkrankheit. Die Häufigkeit von ADPKD ist größer als die von Huntington, Hämophilie, Sichelzellanämie, zystischer Fibrose, myotone Dystrophie und Downsyndrom zusammen.
In den letzten Jahren gab es nicht nur Fortschritte im Verständnis der genetischen und molekularen Grundlagen der ADPKD, auch einige diagnostische und therapeutische Ansätze wurden entwickelt.
Auf dem Gebiet der Genetik wurde das Gen für PKD-I auf dem Chromosom 16 lokalisiert und ist assoziiert mit dem Polycystin-1 Protein, das bei ca. 85% aller Patienten mit ADPKD mutiert ist. Das Gen für PKD-2, das auf Chromosom 4 lokalisiert ist, ist bei 15% der ADPKD Fälle mutiert und ist assoziiert mit dem Polycystin-2 Protein.
Während die Erkenntnisse der Genetik und der Molekularbiologie zahlreiche interessante Projekte der Grundlagenforschung angestoßen haben, hat es jedoch im Bereich der Therapie keine relevanten Forschritte gegeben. Eine Früherkennung und die Behandlung mit Inhibitoren des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems hat das Potenzial, die mit ADPKD häufig einhergehenden hypertrophen Erscheinungen des linken Ventrikels des Herzens zu verhindern und den Fortschritt der Erkrankung zu verzögern.
Die Frühdiagnose der Erkrankung ist damit der Schlüssel zu einer frühen Behandlung und einer Verzögerung des Krankheitsablaufs. Des weiteren ist eine Prognose des Krankheitsverlaufs wichtig, da die therapiebedingten Kosten und Nebenwirkungen nur bei Patienten mit rascher Progression in Kauf genommen werden sollen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Möglichkeit der Diagnose von ADPKD zur Verfügung zu stellen. Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnostik wie Anspruch 1 einer autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Mi rationszeit charakterisiert sind.
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0003
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000006_0003
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
Diese Methode kann auch zur Frühdiagnose sowie zur Prognose der weiteren Krankheitsentwicklung genutzt werden.
Zur Auswertung der gemessenen An- oder Abwesenheiten oder Amplituden der Marker kann auf folgende Referenzwerte zurückgegriffen werden :
Tabelle 2
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Es wird bevorzugt, dass mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Tabelle 1 definiert sind.
Bevorzugt handelt es sich bei der Urinprobe um eine Mittelstrahlurinprobe. Die Verwendung einer humanen Urinprobe ist bevorzugt.
Die Messung der Amplituden und/oder An- oder Abwesenheit kann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen. Geeignete Verfahren sind unter anderem Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspekt- rometrie.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt.
Massenspektrometrie ist zur Messung der Amplitude oder der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker besonders geeignet.
Erfindungsgemäß weist das Verfahren bevorzugt eine Sensitivität von mindestens 60% und eine Spezifität von mindestens 60% auf. Bevorzugt liegt die Sensitivität bei mindestens 70% oder mindestens 80% und die Spezifität bei mindestens 70% oder mindestens 80%.
In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt zunächst eine Auftrennung der Probe in mindestens drei, bevorzugt mindestens 5 oder 10 Teilproben. Anschließend erfolgt eine Analyse von mindestens drei, bevorzugt mindestens 5 oder 10 Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
Die in den Tabellen angegebenen CE-Zeit sind bezogen auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird. Einzelheiten sind im experimentellen Teil enthalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Spezifität ist definiert als die Nummer der tatsächlich negativen Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Negativen und der Anzahl der Falsch-Positiven. Eine Spezifität von 100% bedeutet, dass ein Test alle gesunden Personen als gesund erkennt, d.h. kein Gesunder wird als krank identifiziert. Dies trifft keine Aussage darüber, wie gut der Test kranke Patienten erkennt. Sensitivität ist definiert als die Anzahl der tatsächlichen positiven Proben geteilt durch die Summe der Anzahl der tatsächlich Positiven und die Anzahl der Falsch- Negativen. Eine Sensitivität von 100% bedeutet, dass der Test alle Kranken erkennt. Er trifft keine Aussage, wie gut der Test gesunde Personen erkennt.
Durch die erfindungsgemäßen Markern ist es möglich, für die angegebene Erkrankung, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Spezifität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Durch die erfindungsgemäßen Marker ist es möglich, für die angegebene Erkrankung, für die eine Diagnose gewünscht wird, eine Sensitivität von mindestens 60, bevorzugt mindestens 70, mehr bevorzugt 80, noch mehr bevorzugt mindestens 90 und am meisten bevorzugt mindestens 95% zu erreichen.
Die Migrationszeit wird mittels Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) - wie z.B. in Beispiel unter Punkt 2 ausgeführt - bestimmt. In diesem Beispiel wird eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm und einem äußeren Durchmesser (OD) von 360 μm bei einer angelegten Spannung von 30 kV betrieben.
Als Laufmittel kann zum Beispiel auch 30% Methanol, 0,5% Ameisensäure in Wasser verwendet werden.
Es kann prinzipiell auch mit höheren Ameisensäuregehalten gearbeitet werden, z.B. 0,25%, 0,5%, 0,75% oder 1%.
Es ist bekannt, das die CE-Migrationszeit variieren kann. Dennoch ist die Reihenfolge, mit der die Polypeptidmarker eluieren, für jedes verwendete CE System unter den angegebenen Bedingungen typischerweise gleich. Um dennoch auftretende Unterschiede in der Migrationszeit auszugleichen, kann das System unter Verwendung von Standards, für die die Migrationszeiten genau bekannt sind, normiert werden. Diese Standards können z.B. die in den Beispielen angegebenen Polypeptide sein (siehe Beispiele).
Die Charakterisierung der Polypeptide, die in den Tabellen gezeigt sind, wurde mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) bestimmt, einem Verfahren, das z.B. ausführlich von Neuhoff et al. (Rapid Communications in mass spectrometry , 2004, Bd. 20, Seite 149-156), Coon et al., Proteomics Clin. Appl., 2, 964-973 (2008) und Jantos-Siwy et al., J Proteome Res, in press (Epub Nov 14 2008) beschrieben wurde. Die Variation der Molekülmassen zwischen einzelnen Messungen oder zwischen verschiedenen Massenspektrometern ist bei exakter Kalibrierung relativ klein, typischerweise im Bereich von ± 0,01% oder 0,005%.
Die erfindungsgemäßen Polypeptidmarker sind Proteine oder Peptide oder Abbauprodukte von Proteinen oder Peptiden. Sie können chemisch modifiziert sein, z.B. durch posttranslationale Modifikationen wie Glykolisierung, Phosphorylierung, Alkylierung oder Disulfidverbrückung, oder durch andere Reaktionen, z.B. im Rahmen des Abbaus, verändert sein. Darüber hinaus können die Polypeptidmarker auch im Rahmen der Aufreinigung der Proben chemisch verändert, z.B. oxidiert, sein.
Ausgehend von den Parametern, die die Polypeptidmarker bestimmen (Molekularmasse und Migrationszeit), ist es möglich, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren die Sequenz der entsprechenden Polypeptide zu identifizieren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden verwendet, um ADPKD zu diagnostizieren.
Unter Diagnose versteht man den Vorgang der Erkenntnisgewinnung durch die Zuordnung von Symptomen oder Phänomenen zu einer Krankheit oder Verletzung. Im vorliegenden Fall wird die An- oder Abwesenheit bestimmter Polypeptidmarker auch Differentialdiagnostik genutzt. Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Verfahren, die verwendet werden können, sind weiter unten beispielhaft aufgeführt.
Ein Polypeptidmarker ist anwesend, wenn sein Messwert mindestens so hoch ist wie der Schwellenwert. Liegt sein Messwert darunter, ist der Polypeptidmarker abwesend. Der Schwellenwert kann entweder durch die Sensitivität des Messverfahrens (Nachweisgrenze) bestimmt werden oder anhand von Erfahrungen definiert werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Schwellenwert vorzugsweise überschritten, wenn der Messwert der Probe für eine bestimmte Molekularmasse mindestens doppelt so hoch ist, wie der einer Leerprobe (z.B. nur Puffer oder Lösungsmittel).
Der oder die Polypeptidmarker wird/werden in der Weise verwendet, dass seine/ihre An- oder Abwesenheit gemessen wird, wobei die An- oder Abwesenheit indikativ für ADPKD ist. So gibt es Polypeptidmarker, die typischerweise bei Individuen mit ADPKD vorhanden sind, jedoch bei Individuen ohne ADPKD seltener oder gar nicht auftreten. Weiterhin gibt es Polypeptidmarker, die bei Patienten mit ADPKD vorhanden sind, jedoch bei Patienten ohne ADPKD nicht oder nur seltener vorhanden sind.
Zusätzlich oder auch alternativ zu den Frequenzmarkern (Bestimmung der An- oder Abwesenheit) können auch Amplitudenmarker zur Diagnose verwendet werden. Amplitudenmarker werden in der Weise verwendet, das nicht die An oder Abwesenheit entscheidend ist, sondern die Höhe des Signals (die Amplitude) bei Anwesenheit des Signals in beiden Gruppen entscheidet. In den Tabellen sind die mittleren Amplituden der entsprechenden Signale (charakterisiert über Masse and Migrationszeit) über alle gemessenen Proben angegeben. Dabei sind zwei Nominierungsverfahren möglich, um eine Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlich konzentrierten Proben oder unterschiedlichen Messmethoden zu erreichen. Im ersten Ansatz werden alle Peptidsignale einer Probe auf eine Gesamtamplitude von 1 Million Counts normiert. Die jeweiligen mittleren Amplituden der Einzelmarker sind daher als parts per million (ppm) angegeben.
Zusätzlich besteht die Möglichkeit über ein alternatives Normierungsverfahren weitere Amplitudenmarker zu definieren : in diesem Fall werden alle Peptidsignale einer Probe mit einem gemeinsamen Normierungsfaktor skaliert, wie z.B. in Theodorescu et al, Electrophoresis, 26: 2797-808 (2005), ausgeführt. Dazu wir eine lineare Regression zwischen den Peptid-Amplituden der einzelnen Proben und den Referen zweiten aller bekannten Polypeptide gebildet. Die Steigerung der Regressionsgeraden entspricht gerade der relativen Konzentration und wird als Normierungsfaktor für diese Probe verwandt.
Alle verwendeten Gruppen bestehen aus mindestens 20 einzelnen Patientenoder Kontrollproben, um eine verlässliche mittlere Amplitude zu erhalten. Die Entscheidung zu einer Diagnose fällt dabei je nachdem, wie hoch die Amplitude der jeweiligen Polypeptidmarker in der Patientenprobe im Vergleich zu den mittleren Amplituden in der Kontrollgruppe bzw. der "Krank"-Gruppe ist. Liegt der Wert nahe an der mittleren Amplitude der "Krank"-Gruppe, ist von dem Vorliegen einer ADPKD auszugehen, entspricht sie eher den mittleren Amplituden der Kontroll-Gruppe, ist nicht von einer ADPKD auszugehen. Der Abstand zur mittleren Amplitude kann als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe interpretiert werden.
Alternativ kann der Abstand zwischen dem Messwert und der mittleren Amplitude als eine Wahrscheinlichkeit für die Zugehörigkeit zu einer Gruppe betrachtet werden.
Ein Frequenzmarker ist eine Variante des Amplitudenmarkers, bei dem in einigen Proben die Amplitude gering ist. Es ist möglich, solche Frequenzmarker in Ampli- tudenmarker umzurechnen, in dem in die Berechnung der Amplitude die entsprechenden Proben, bei denen der Marker nicht gefunden wird, mit einer sehr kleinen Amplitude - im Bereich der Nachweisgrenze - in die Berechnung eingeht.
Das Individuum, von dem die Probe stammt, in der die An- oder Abwesenheit eines oder mehrerer Polypeptidmarker bestimmt wird, kann jedes Individuum sein, das an ADPKD leiden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Individuum um ein Säugetier, am meisten bevorzugt handelt es sich um einen Menschen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nicht nur drei Polypeptidmarker, sondern eine größere Kombination von Markern verwendet, um Differentialdiagnostik zu ermöglichen. Durch Vergleich einer Mehrzahl von Polypeptidmarkern kann die Verfälschung des Gesamtergebnisses durch einzelne individuelle Abweichungen von der typischen Anwesenheitswahrscheinlichkeit im einzelnen Individuum reduziert oder vermieden werden.
Bei der Probe, in der die An- oder Abwesenheit des oder der erfindungsgemäßen Polypeptidmarker gemessen werden, kann es sich um jede Probe handeln, die aus dem Körper des Individuums gewonnen wird. Bei der Probe handelt es sich um eine Probe, die über eine Polypeptidzusammensetzung verfügt, die geeignet ist, Aussagen über den Zustand des Individuums zu treffen. Beispielsweise kann es sich um Blut, Urin, eine Gelenkflüssigkeit, eine Gewebeflüssigkeit, ein Körpersekret, Schweiß, Liquor, Lymphe, Darm-, Magen-, Pankreassaft, Galle, Tränenflüssigkeit, eine Gewebeprobe, Sperma, Vaginalflüssigkeit oder eine Stuhlprobe handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine Flüssigprobe. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine Urinprobe.
Urinproben können wie im Stand der Technik bekannt genommen werden. Vorzugsweise wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Mittelstrahlurinprobe verwendet. Die Urinprobe kann z.B. mittels eines Katheters oder auch mit Hilfe eines Urinierungsapparates, wie in WO 01/74275 beschrieben, entnommen werden.
Die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers in der Probe kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren, das zur Messung von Polypeptidmarkern geeignet ist, bestimmt werden. Dem Fachmann sind solche Verfahren bekannt. Grundsätzlich kann die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers durch direkte Verfahren, wie z.B. Massenspektrometrie, oder indirekte Verfahren, wie z.B. mittels Liganden, bestimmt werden.
Falls erforderlich oder wünschenswert kann die Probe des Individuums, z.B. die Urinprobe, vor der Messung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker durch jedes geeignete Mittel vorbehandelt und z.B. aufgereinigt oder aufgetrennt werden. Die Behandlung kann z.B. eine Aufreinigung, Trennung, Verdünnung oder Konzentrierung umfassen. Die Verfahren können beispielsweise eine Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, Dialyse, eine Fällung oder chromatographische Verfahren wie Affinitätstrennung oder Trennung mittels Ionenaustauscherchromatographie, oder eine elektrophoreti- sche Trennung sein. Besondere Beispiele hierfür sind Gelelektrophorese, zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), Kapillarelektrophorese, Metallaffinitätschromatographie, immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), Affinitätschromatographie auf der Basis von Lektinen, Flüssigchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Normal- und Umkehrpha- sen-HPLC, Kationenaustauscherchromatographie und selektive Bindung an Oberflächen. Alle diese Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und der Fachmann wird das Verfahren in Abhängigkeit von der verwendeten Probe und dem Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit des oder der Polypeptidmarker auswählen können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Probe vor ihrer Messung mittels Elektrophorese aufgetrennt, mittels Ultrazentrifugation gereinigt und/oder mittels Ultrafiltration in Fraktionen, die Polypeptidmarker bestimmter molekularer Größe enthalten, aufgetrennt.
Vorzugsweise wird ein massenspektrometrisches Verfahren verwendet, um die An- oder Abwesenheit eines Polypeptidmarkers zu bestimmen, wobei diesem Verfahren eine Aufreinigung oder Auftrennung der Probe vorgeschaltet werden kann. Die massenspektrometrische Analyse besitzt gegenüber den derzeit gängigen Verfahren den Vorteil, dass die Konzentration vieler (> 100) Polypeptide einer Probe mittels einer einzigen Analyse bestimmt werden kann. Jeder Typ eines Massenspektrometers kann verwendet werden. Mit der Massenspektrometrie ist es möglich, routinemäßig 10 fmol eines Polypeptidmarkers, also 0,1 ng eines 10 kDa Proteins mit einer Messgenauigkeit von ca. ±0,01% aus einem komplexen Gemisch zu vermessen. Bei Massenspektrometern ist eine Ionen- bildende Einheit mit einem geeigneten Analysegerät gekoppelt. Zum Beispiel werden meistens Elektrospray-Ionisations (ESI) Interfaces verwendet, um Ionen aus Flüssigproben zu vermessen, wohingegen die Matrix-assisted-laser- desorption/ionisation (MALDI) Technik verwendet wird, um Ionen aus mit einer Matrix kristallisierten Probe zu vermessen. Zur Analyse der entstandenen Ionen können z.B. Quadrupole, Ionenfallen oder Time-of-flight (TOF) Analysatoren verwendet werden.
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) werden die in Lösung vorliegenden Moleküle u.a. unter dem Einfluss von Hochspannung (z.B. 1-8 kV) versprüht, wobei sich geladene Tröpfchen bilden, die durch Verdampfen des Lösungsmittels kleiner werden. Schließlich kommt es durch sog. Coulomb-Explosionen zur Bildung freier Ionen, die dann analysiert und detektiert werden können.
Bei der Analyse der Ionen mittels TOF wird eine bestimmte Beschleunigungsspannung angelegt, die den Ionen eine gleich große kinetische Energie verleiht. Dann wird sehr genau die Zeit gemessen, die die jeweiligen Ionen benötigen, um eine Driftstrecke durch das Flugrohr zurückzulegen. Da bei gleicher kinetische Energie die Geschwindigkeit der Ionen von Ihrer Masse abhängt, kann diese somit bestimmt werden. TOF-Analysatoren haben eine sehr hohe Scan- Geschwindigkeit und erreichen eine sehr hohe Auflösung.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit von Polypeptid- markern schließen Gasphasenionenspektrometrie, wie Laserdesorptions /Ionisations-Massenspektrometrie, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (Surface enhanced laser desorption ionisation), LC-MS (Liquid chromatography- mass spectrometry), 2D-PAGE-MS und Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) ein. Alle genannten Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist CE-MS, in welchem die Kapillarelektrophorese mit Massenspektrometrie gekoppelt wird. Dieses Verfahren ist ausführlich z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 10021737, bei Kaiser et al. (J. Chromatogr. A1 2003, Bd. 1013: 157-171, sowie Electrophoresis, 2004, 25: 2044- 2055) und bei Wittke et al. (J. Chromatogr. A1 2003, 1013: 173-181) beschrieben. Die CE-MS Technik erlaubt, das Vorhandensein einiger Hunderter Polypeptidmarker einer Probe gleichzeitig in kurzer Zeit, einem geringen Volumen und hoher Sensitivität zu bestimmen. Nachdem eine Probe vermessen wurde, wird ein Muster der gemessenen Polypeptidmarker hergestellt. Dieses kann mit Referenzmustern von kranken bzw. gesunden Individuen verglichen werden. In den meisten Fällen ist es ausreichend, eine begrenzte Anzahl von Polypeptidmarkern für die Diagnostik von UAS zu verwenden. Weiter bevorzugt ist ein CE-MS Verfahren, das CE online an ein ESI-TOF-MS gekoppelt, einschließt.
Für CE-MS ist die Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln bevorzugt, außerdem arbeitet man am besten unter im Wesentlichen salzfreien Bedingungen. Beispiele geeigneter Lösungsmittel umfassen Acetonitril, Methanol und ähnliche. Die Lösungsmittel können mit Wasser verdünnt und mit einer Säure (z.B. 0,1% bis 1% Ameisensäure) versetzt sein, um den Analyten, vorzugsweise die Polypeptide, zu protonieren. Mit der Kapillarelektrophorese ist es möglich, Moleküle nach ihrer Ladung und Größe zu trennen. Neutrale Teilchen wandern beim Anlegen eines Stromes mit der Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses, Kationen werden zur Kathode beschleunigt und Anionen verzögert. Der Vorteil von Kapillaren in der Elektrophorese besteht im günstigen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, was einen guten Abtransport der beim Stromfluss entstehenden Jouleschen Wärme ermöglicht. Dies wiederum erlaubt das Anlegen hoher Spannungen (üblicherweise bis 30 kV) und damit eine hohe Trennleistung und kurze Analysezeiten.
Bei der Kapillarelektrophorese werden normalerweise Quarzglaskapillaren mit Innendurchmessern von typischerweise 50 bis 75 μm eingesetzt. Die verwendeten Längen betragen 30-100 cm. Darüber hinaus bestehen die Kapillaren in der Regel aus kunststoffumhüllten Quarzglas. Die Kapillaren können sowohl unbehandelt sei, d.h. auf der Innenseite ihre hydrophilen Gruppen zeigen, als auch auf der Innenseite beschichtet sein. Eine hydrophobe Beschichtung kann verwendet werden, um die Auflösung zu verbessern. Zusätzlich zur Spannung kann auch ein Druck angelegt werden, der typischerweise im Bereich von 0-1 psi liegt. Der Druck kann dabei auch erst während der Trennung angelegt oder währenddessen verändert werden.
In einem bevorzugten Verfahren zur Messung von Polypeptidmarkern werden die Marker der Probe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, anschließend direkt ionisiert und online in ein daran gekoppeltes Massenspektrometer zur Detektion überführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können in vorteilhafter Weise mehrere Polypeptidmarker zur Diagnostik verwendet werden.
Bevorzugt ist die Verwendung von mindestens 5, 6, 8, oder 10 Markern. In einer Ausführungsform werden 20 bis 50 Marker verwendet.
Um die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer Erkrankung bei Verwendung mehrerer Marker zu bestimmen, können dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann das von Weissinger et al. (Kidney Int., 2004, 65: 2426-2434) beschriebene Random-Forests-Verfahren unter Verwendung eines Computerprogramms wie z.B. S-Plus oder die in der selben Veröffentlichung beschriebenen support-vector-machines verwendet werden. Eine weitere Möglichkeit stellt die Linearkombination von individuellen Signalen dar, wie z.B. in Rossing et al., J Am Soc Nephral. (2008) 19(7) : 1283-90, beschrieben.
Figur 1 zeigt die summierten Daten von Urinproben von Kontrollpatienten und ADPKD Patienten.
Figur 2 zeigt die "Receiver Operating Characteristic" Kurven für das Training und das Testset.
Beispiel:
1. Probenvorbereitunq :
Zur Detektion der Polypeptidmarker zur Diagnostik wurde Urin verwendet. Urin wurde von gesunden Spendern (Vergleichsgruppe), Patienten, die an einer chro- nischen Nierenerkrankung oder Nieren- oder Blasenkarzinom ("Krankheitskontrolle") sowie Patienten, die an ADPKD leiden, abgenommen.
Für die nachfolgende CE-MS Messung mussten die auch in Urin von Patienten in höherer Konzentration vorkommenden Proteine wie Albumin und Immunoglobuline durch Ultrafiltration abgetrennt werden. Dazu wurden 700 μl Urin entnommen und mit 700 μl Filtrationspuffer (2M Harnstoff, 1OmM Ammoniak, 0,02% SDS) versetzt. Diese 1,4 ml Probenvolumen wurden ultrafiltriert (20 kDa, Sartorius, Göttingen, DE). Die UF wurde bei 3000 U/min in einer Zentrifuge durchgeführt bis 1,1 ml Ultrafiltrat erhalten wurden.
Die erhaltenen 1,1 ml Filtrat wurden dann auf eine PD 10 Säule aufgetragen (Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden) und gegen 2,5 ml 0,01% NH4OH entsalzt und lyophillisert. Zur CE-MS Messung wurden die Polypeptide dann mit 20 μl Wasser (HPLC-Reinheit, Merck) resuspendiert.
2. CE-MS Messung :
Die CE-MS Messungen wurden mit einem Kapillarelektrophoresesystem von Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Ine, Fullerton, USA) und einem ESI-TOF Massenspektrometer von Bruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D) durchgeführt.
Die CE Kapillaren wurden von Beckman Coulter bezogen, sie hatten einen ID/OD von 50/360 μm und eine Länge von 90 cm. Die mobile Phase für die CE Trennung bestand aus 20% Acetonitril und 0,25% Ameisensäure in Wasser. Für den „Sheath-Flow" am MS wurde 30% Isopropanol mit 0,5% Ameisensäure verwendet, hier mit einer Flussrate von 2 μl/min. Die Kopplung von CE und MS wurde durch ein CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, DE) realisiert.
Um die Probe zu injizieren, wurde 1 bis max. 6 psi Druck angelegt, die Dauer der Injektion betrug 99 Sekunden. Mit diesen Parametern wurden ca. 150 nl der Probe in die Kapillare injiziert, dieses entspricht ca. 10% des Kapillarvolumens. Um die Probe in der Kapillare aufzukonzentrieren wurde eine „Stacking"-Technik verwendet. Dabei wird vor der Probeninjektion für 7 Sek. (bei 1 psi) eine IM NH3 Lösung injiziert, nach der Probeninjektion für 5 Sek. eine 2M Ameisensäurelösung. Nach Anlegen der Trennspannung (30 kV) werden die Analyten zwischen diesen Lösungen automatisch aufkonzentriert.
Die folgende CE-Trennung wurde mit einer Druckmethode durchgeführt: 40 Minuten mit 0 psi, dann für 2 min 0,1 psi, für 2 min 0,2 psi, für 2 min 0,3 psi, für 2 min 0,4 psi, abschließend 17 min bei 0,5 psi. Die Gesamtdauer eines Trennlaufes betrug damit 65 Minuten.
Um auf der Seite des MS eine möglichst gute Signalintensität zu erhalten, wurde das "Nebulizer Gas" auf den niedrigsten möglichen Wert eingestellt. Die an der Spraynadel angelegte Spannung zur Erzeugung des Elektrosprays betrug 3700 - 4100 V. Die übrigen Einstellungen am Massenspektrometer wurden gemäß Anweisung des Herstellers für Peptiddetektion optimiert. Die Spektren wurden über einen Massenbereich von m/z 400 bis m/z 3000 aufgenommen und alle 3 Sek. akkumuliert. 3. Standards für die CE-Messunq
Zur Kontrolle und Kalibrierung der CE-Messung wurden die folgenden Proteine bzw. Polypeptide eingesetzt, welche unter den gewählten Bedingungen durch die unten aufgeführten CE-Migrationszeiten charakterisiert sind :
Protein/Polypeptid Migrationszeit
Aprotinin, (SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr. A1153) 19,3 min
Ribonuclease, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; R4875 19,55min
Lysozym, SIGMA, Taufkirchen, DE; Kat.Nr.; L7651 19,28 min
"REV", Sequenz: REVQSKIGYG RQIIS 20,95 min
"ELM", Sequenz: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23,49 min
"KINCON", Sequenz: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 22,62 min
"GIVLY" Sequenz: GIVLYELMTGELPYSHIN 32,2 min
Die Proteine/Polypeptide werden jeweils in einer Konzentration von 10 pmol/μl in Wasser eingesetzt. "REV", "ELM", "KINCON" und "GIVLY" stellen synthetische Peptide dar.
Es ist dem Fachmann prinzipiell bekannt, dass bei kapillarelektrophoretischen Trennungen geringe Schwankungen der Migrationszeiten auftreten können. Unter den beschriebenen Bedingungen ändert sich jedoch die Migrationsreihenfolge nicht. Es ist für den Fachmann in Kenntnis der angegebenen Massen und CE- Zeiten problemlos möglich, eigene Messungen den erfindungsgemäßen Polypeptidmarkern zuzuordnen. Hierzu kann er beispielsweise wie folgt vorgehen : zunächst wählt er eines der in seiner Messung gefundenen Polypeptide (Peptid 1) aus und versucht, innerhalb eines Zeitfensters der angegebenen CE- Zeit (beispielsweise ± 5 min) eine oder mehrere übereinstimmende Massen zu finden. Findet er innerhalb dieses Intervalls nur eine übereinstimmende Masse, ist die Zuordnung fertiggestellt. Findet er mehrere passende Massen, muss noch eine Entscheidung über die Zuordnung gefällt werden. Hierzu wird ein weiteres Peptid (Peptid 2) aus der Messung ausgewählt und versucht, hierfür einen passenden Polypeptidmarker zu identifizieren, wobei wieder ein entsprechendes Zeitfenster berücksichtigt wird.
Lassen sich nun wiederum mit einer entsprechenden Masse mehrere Marker finden, ist die wahrscheinlichste Zuordnung die, bei der zwischen der Verschiebung für das Peptide 1 und für das Peptid 2 ein im wesentlichen linearer Zusammenhang besteht.
In Abhängigkeit von der Komplexität des Zuordnungsproblems bietet es sich für den Fachmann an, gegebenenfalls weitere Proteine aus seiner Probe für die Zuordnung zu verwenden, beispielsweise zehn Proteine. Typischerweise sind die Migrationszeiten entweder um gewisse absolute Werte verlängert oder verkürzt oder es treten Stauchungen oder Strickungen des gesamten Verlaufs auf. Comigrierende Peptide comigrieren aber auch unter solchen Bedingungen. Zudem kann der Fachmann sich die von Zuerbig et al. in Electrophoresis 27 (2006), Seiten 2111 - 2125 beschriebenen Migrationsmuster zu nutze machen. Wenn er mit Hilfe eines einfachen Diagramms (z.B. mit MS Excel) seine Messung in Form von m/z versus Migrationszeit plottet, werden ebenfalls die beschriebenen Linienmuster sichtbar. Durch Abzählen der Linien ist nun eine einfache Zuordnung der einzelnen Polypeptide möglich.
Auch andere Vorgehensweisen zur Zuordnung sind möglich. Grundsätzlich könnte der Fachmann auch die oben genannten Peptide als internen Standard verwenden, um seine CE-Messungen zuzuordnen.
Prüfung der Marker
Zuerst wurden Urinproben von 17 Patienten mit ADPKD verglichen mit 86 Proben von als gesund eingestuften Kontrollpatienten. Die summierten Daten sind in Figur 1 dargestellt. Es gelang die Identifizierung von 383 Biomarkern, die statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zeigen.
In einem Testmodell zur Auswertung konnte eine Unterscheidung mit einer 100%igen Sensitivität und einer 98,8%igen Spezifität erreicht werden.
Zur Validierung der Marker wurden 150 weitere Proben untersucht und mit dem erstellen Model geprüft. Die Sensitivität war 87,5% und die Spezifität war 97,5%. Die ROC-Kurven für das Training- und auch das Testset sind in Figur 2 gezeigt.
Um die Spezifität der Biomarker für ADPKD zu überprüfen, wurden weiteren Kontrollen hinzugenommen. Mit gesunden Kontrollen ergab sich eine Spezifität von 93%, für Patienten mit anderen chronischen Nierenerkrankungen eine 95% Spezifität, für Blasenkrebs 85% Spezifität und für Nierentumore 83% Spezifität.
Außerdem wurde eine Gruppe von Gesunden mit einem Alter > 60 Jahre hinzugefügt. Hier zeigte sich eine Spezifität von nur 69%.
Für einige der 383 potentielle Biomarker war es möglich, Sequenzinformationen zu ermitteln. Bei einer Analyse nur aufbauend aus den 75 sequenzierten Peptiden ergab sich im Trainingset eine Sensitivität von 100% und eine Spezifität von 95,5%. Nach Crossvalidierung wurde eine Sensitivität on 94,1% und eine Spezifität von 94,2% erhalten. Dieses Model wurde wieder gegen ein Testset getestete. Hier betrug die Sensitivität 66,7% und die Spezifität 99,1%. Es zeigt sich, dass die zusätzlichen bisher noch nicht sequenzierten Biomarker die Leistungsfähigkeit der Diagnostik weiter erhöhen.
Allerdings zeigten die 75 Biomarker bereits eine AUC von 0,89, sind also hervorragend geeignet.
Die hier erhaltenen Sequenzinformationen sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3: '''NrVl'''''''''''''''''''''''''^ Name j Start AA I Stop AA I
1 KGDTGPpGP Collagen alpha-1 (IM) chain 629 637
17 VLNLGPITR Uromodulin 598 606
19 YQTNKAKH Cystatin-B 85 92
24 ApGDKGESGPS Collagen alpha-1 (I) chain 777 787 Seqüence fsfam© | Stert,,,M| Stop,,,AAl SpGPDGKTGPp Collagen alpha-1 (I) chain 546 556 ApGDRGEpGPp Collagen alpha-1 (I) chain 798 808 GPPGppGpPGPPS Collagen alpha-1 (I) chain 1181 1193 MIEQNTKSPL Alpha-1 -antitrypsin 398 407 DDGEAGKpGRpG Collagen alpha-1 (I) chain 231 242 SpGPDGKTGPPGp Collagen alpha-1 (I) chain 546 558 GPpGEAGKpGEQG Collagen alpha-1 (I) chain 650 662 DKGETGEQGDRG Collagen alpha-1 (I) chain 1095 1106 SpGSpGPDGKTGPp Collagen alpha-1 (I) chain 543 556 DSGSSEEQGGSSRA Polymeric-immunoglobulin receptor 626 639 GSpGGpGSDGKpGPpG Collagen alpha-1 (IM) chain 540 555 GLPGPpGPpGSFLSN Collagen alpha-1 (XVII) chain 885 899 PpGKNGDDGEAGKpG Collagen alpha-1 (I) chain 225 239 SpGSPGPDGKTGPpGP Collagen alpha-1 (I) chain 543 558 GLpGTGGPpGENGKpG Collagen alpha-1 (IM) chain 642 657 TIDEKGTEAAGAMF Alpha-1 -antitrypsin 363 376 ApGKNGERGGpGGpGP Collagen alpha-1 (IM) chain 589 604 DQSRVLNLGPITR Uromodulin 594 606 DGQPGAKGEpGDAGAK Collagen alpha-1 (I) chain 820 835 GPpGKNGDDGEAGKpG Collagen alpha-1 (I) chain 224 239 VGPpGpPGPPGPPGPPS Collagen alpha-1 (I) chain 1174 1190 SpGSpGPDGKTGPPGpA Collagen alpha-1 (I) chain 543 559 VIDQSRVLNLGPIT Uromodulin 592 605 PpGEAGKpGEQGVpGD Collagen alpha-1 (I) chain 651 666 DGQpGAKGEpGDAGAKG Collagen alpha-1 (I) chain 820 836 GSEADHEGTHSTKRG Fibrinogen alpha chain 608 622 SpGSpGPDGKTGPPGpAG Collagen alpha-1 (I) chain 543 560 IDQSRVLNLGPITR Uromodulin 593 606 TGLSMDGGGSPKGDVDP NA/K-ATPase gamma chain 2 18 DGApGKNGERGGpGGpGP Collagen alpha-1 (IM) chain 587 604 EGSpGRDGSpGAKGDRG Collagen alpha-1 (I) chain 1021 1037 VGPpGPpGPpGPPGPPSAG Collagen alpha-1 (I) chain 1177 1195 AGSEADHEGTHSTKRG Fibrinogen alpha chain 607 622 SGSVIDQSRVLNLGPI Uromodulin 589 604 KpGEQGVpGDLGApGPSG Collagen alpha-1 (I) chain 657 674 VIDQSRVLNLGPITR Uromodulin 592 606 GLpGTGGPpGENGKpGEp Collagen alpha-1 (IM) chain 642 659 DHDVGSELPPEGVLGAL ProSAAS 223 239 GLpGTGGPpGENGKPGEPGp Collagen alpha-1 (IM) chain 642 661 GLpGTGGPpGENGKpGEPGp Collagen alpha-1 (IM) chain 642 661 EGSpGRDGSpGAKGDRGET Collagen alpha-1 (I) chain 1021 1039 SGSVIDQSRVLNLGPITR Uromodulin 589 606 DGESGRPGRPGERGLPGPPG Collagen alpha-1 (IM) chain 230 249 AGpPGPPGppGTSGHpGSpGSpG Collagen alpha-1 (IM) chain 176 198 NSGEpGApGSKGDTGAKGEpGP Collagen alpha-1 (I) chain 432 453 EGSpGRDGSpGAKGDRGETGP Collagen alpha-1 (I) chain 1021 1041 SGSVIDQSRVLNLGPITRK Uromodulin 589 607 DAGApGApGGKGDAGApGERGPpG Collagen alpha-1 (IM) chain 586 604 GAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPG Collagen alpha-1 (I) chain 701 725 NGEpGGKGERGApGEKGEGGpPG Collagen alpha-1 (IM) chain 818 840 AGPpGEAGKpGEQGVpGDLGAPGP Collagen alpha-1 (I) chain 646 669 GRTGDAGPVGPPGPpGppGpPGPPS Collagen alpha-1 (I) chain 1169 1193 QNGEpGGKGERGAPGEKGEGGppG Collagen alpha-1 (IM) chain 817 840 ADGQpGAKGEpGDAGAKGDAGpPGPAGP Collagen alpha-1 (I) chain 819 846 TGPIGPpGPAGApGDKGESGPSGPAGPTG Collagen alpha-1 (I) chain 766 794 GPpGADGQpGAKGEpGDAGAKGDAGpPGP Collagen alpha-1 (I) chain 815 843 LILI Seqüence fsfam© | Stert,,,M| Stop,,,AAl
266 DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRP Fibrinogen alpha chain 605 628
268 DDILASPPRLPEPQPYPGAPHHSS Collagen alpha- 1 (XVIII) chain 1296 1319
271 AGPpGApGApGApGPVGPAGKSGDRGETGP Collagen alpha-1 (I) chain 1042 1071
273 QGpPGPSGEEGKRGPNGEAGSAGPPGppG Collagen alpha-2 (I) chain 369 397
280 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL Serum albumin; N-term. 25 48
281 KEGGKGPRGETGPAGRpGEVGpPGPpGPAG Collagen alpha-1 (I) chain 903 932
282 ERGEAGIpGVpGAKGEDGKDGSpGEpGANG Collagen alpha-1 (IM) chain 448 477 288 ESGREGApGAEGSpGRDGSpGAKGDRGETGP Collagen alpha-1 (I) chain 1011 1041 293 LTGSpGSpGpDGKTGPPGPAGQDGRPGPpGppG Collagen alpha-1 (I) chain 537 569 302 PpGESGREGAP- Collagen alpha-1 (I) chain 1008 1041
GAEGSpGRDGSpGAKGDRGETGP 312 NTGApGSpGVSGpKGDAGQp- Collagen alpha-1 (IM) chain 910 946
GEKGSPGAQGPPGAPGp
316 EEKAVADTRDQADGSRASVDSGSSEEQGGSSRA Polymeric-immunoglobulin receptor 607 639 320 ARGNDGARGSDGQPGPpGppGTAGFpGSpGAK- Collagen alpha-1 (IM) chain 319 355
GEVGP 325 NTGAPGSpGVSGpKGDAGQpGEKGSpGAQGpPG Collagen alpha-1 (IM) chain 910 948
APGPLG 334 GRPEAQPPPLSSEHKEPVAGDAVPGPKDGSAPE Neurosecretory protein VGF 26 62
VRGA

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnostik, Frühdiagnostik und zur Prognose der klinischen Entwicklung einer autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) umfassend den Schritt der Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude von mindestens drei Polypeptidmarkern in einer Urinprobe, wobei die Polypeptidmarker ausgewählt sind aus den Markern, die in Tabelle 1 durch Werte für die Molekularmassen und die Migrationszeit charakterisiert sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Diagnostik eine Differentialdiagnostik zwischen ADPKD und einer oder mehrerer Erkrankungen ausgewählt aus chronischen Nierenerkrankungen, Nierenkrebs und Blasenkrebs ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertung der bestimmten An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Marker anhand der Referenzwerte der Tabelle 2 erfolgt.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens fünf, mindestens sechs, mindestens acht, mindestens zehn, mindestens 20 oder mindestens 50 Polypeptidmarker verwendet werden, wie sie in Anspruch 1 definiert sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Urinprobe eine Mittelstrahlurinprobe ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Kapillarelektrophorese, HPLC, Gasphasenionenspektrometrie und/oder Massenspektrometrie zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptidmarker verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei vor einer Messung der Molekularmasse der Polypeptidmarker eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Massenspektrometrie zum Nachweis der An- oder Abwesenheit des/der Polypeptidmarker und/oder zur Identifizierung der Polypeptidmarker verwendet wird.
9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Sensiti- vität mindestens 60% und die Spezifität mindestens 60% beträgt.
10. Verfahren zur Diagnose einer autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) umfassend die Schritte a) der Auftrennung einer Probe in mindestens drei, bevorzugt mindestens 10 Teilproben, b) Analyse von mindestens drei, bevorzugt mindestens 10 Teilproben zur Bestimmung einer An- oder Abwesenheit oder Amplitude mindestens eines Polypeptidmarkers in der Probe, wobei der Polypeptidmarker ausgewählt ist aus den Markern der Tabelle 1, die durch die Molekularmassen und Migrationszeit (CE-Zeit) charakterisiert sind.
11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet dass die CE-Zeit bezogen ist auf eine 90 cm lange Glaskapillare mit einem inneren Durchmesser (ID) von 50 μm bei einer angelegten Spannung von 25 kV, wobei als Laufmittel 20% Acetonitril, 0,25% Ameisensäure in Wasser verwendet wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 3 Marker verwendet werden, die in Tabelle 3 definiert sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 5, 10, 20, 30, 50 oder alle Marker verwendet werden, die in Tabelle 3 definiert sind.
14. Vorrichtung zur quantitativen Auswertung der in einer Urinprobe gefundenen Polypeptidmarker, wobei die Vorrichtung eine Datenbank umfasst, die Datensätze enthält, die Referenz werten von Polypeptiden entsprechen und Angaben über die An- oder Abwesenheit oder Amplitude der Polypeptide in Proben von gesunden oder kranken Probanden umfasst, wobei die Datenbank mindestens Angaben hinsichtlich der Identität der Marker und der An- und Abwesenheit oder Amplitude für drei Polypeptidmarker aus Tabelle 1 enthält.
PCT/EP2009/067430 2008-12-17 2009-12-17 Autosomal dominante polyzystische nierenerkrankung (adpkd) WO2010079076A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09796710A EP2394171A2 (de) 2008-12-17 2009-12-17 Autosomal dominante polyzystische nierenerkrankung (adpkd)
US13/140,106 US20110297543A1 (en) 2008-12-17 2009-12-17 Autosomal-Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD)
US14/575,582 US20150346150A1 (en) 2008-12-17 2014-12-18 Autosomal-dominant polycystic kidney disease (adpkd)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08171983 2008-12-17
EP08171983.3 2008-12-17

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/140,106 A-371-Of-International US20110297543A1 (en) 2008-12-17 2009-12-17 Autosomal-Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD)
US14/575,582 Continuation US20150346150A1 (en) 2008-12-17 2014-12-18 Autosomal-dominant polycystic kidney disease (adpkd)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2010079076A2 true WO2010079076A2 (de) 2010-07-15
WO2010079076A3 WO2010079076A3 (de) 2010-09-23

Family

ID=40418967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2009/067430 WO2010079076A2 (de) 2008-12-17 2009-12-17 Autosomal dominante polyzystische nierenerkrankung (adpkd)

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20110297543A1 (de)
EP (1) EP2394171A2 (de)
WO (1) WO2010079076A2 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3239173A3 (de) * 2011-07-20 2018-01-24 Nordic Bioscience A/S Biomarkertest für die pathologie

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE519116T1 (de) * 2007-03-07 2011-08-15 Mosaiques Diagnostics & Therap Verfahren zur normierung der konzentration von analyten in einer urinprobe
EP1972940A1 (de) * 2007-03-14 2008-09-24 mosaiques diagnostics and therapeutics AG Verfahren und Marker zur Diagnose von Nierenerkrankungen
EP2255203A2 (de) * 2008-03-19 2010-12-01 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics AG Verfahren und marker zur diagnose von tubulären nierenschäden und -erkrankungen
EP2338054A1 (de) * 2008-09-17 2011-06-29 Mosaiques Diagnostics And Therapeutics AG Nierenzellkarzinom

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1808694A1 (de) * 2006-01-17 2007-07-18 Universitätsklinikum Freiburg Verfahren zur Diagnose von polyzystischer Nierenerkrankung

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1808694A1 (de) * 2006-01-17 2007-07-18 Universitätsklinikum Freiburg Verfahren zur Diagnose von polyzystischer Nierenerkrankung

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DECRAMER STÉPHANE ET AL: "Urine in clinical proteomics" MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, INC, US, Bd. 7, Nr. 10, 1. Oktober 2008 (2008-10-01), Seiten 1850-1862, XP009111426 ISSN: 1535-9476 *
JANTOS-SIWY JUSTYNA ET AL: "Quantitative Urinary Proteome Analysis for Biomarker Evaluation in Chronic Kidney Disease" JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, Bd. 8, Nr. 1, Sp. Iss. SI, November 2008 (2008-11), Seiten 268-281, XP002520005 ISSN: 1535-3893 *
See also references of EP2394171A2 *
THEREZO ALTINO LUIZ SILVA ET AL: "Histogenesis of the cysts in the autosomal dominant polycystic kidney disease: An immunohistochemical study" APPLIED IMMUNOHISTOCHEMISTRY, LIPPINCOTT WILLIAMS AND WILKINS, PHILADELPHIA, PA, US, Bd. 6, Nr. 4, 1. Dezember 1998 (1998-12-01), Seiten 219-223, XP009113981 ISSN: 1062-3345 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3239173A3 (de) * 2011-07-20 2018-01-24 Nordic Bioscience A/S Biomarkertest für die pathologie

Also Published As

Publication number Publication date
EP2394171A2 (de) 2011-12-14
US20150346150A1 (en) 2015-12-03
WO2010079076A3 (de) 2010-09-23
US20110297543A1 (en) 2011-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2338054A1 (de) Nierenzellkarzinom
EP2255203A2 (de) Verfahren und marker zur diagnose von tubulären nierenschäden und -erkrankungen
EP2118667A2 (de) Verfahren und marker zur diagnose von nierenerkrankungen
EP2333550A2 (de) Polypeptidmarker zur Diagnose von Blasenkrebs
EP1955064A1 (de) Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung der ureterabgangsstenose
EP1287348A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur qualitativen und/oder quantitativen bestimmung eines protein- und/oder peptidmusters einer flüssigkeitsprobe, die dem menschlichen oder tierischen körper entnommen wird
EP2317320A2 (de) Polypeptidmarker zur Diagnose von Prostatakrebs
WO2011000938A1 (de) Verfahren und marker zur diagnose eines akuten nierenversagens
WO2010079076A2 (de) Autosomal dominante polyzystische nierenerkrankung (adpkd)
EP2810077A2 (de) Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung der herzinsuffizienz
WO2009050300A1 (de) Verfahren und marker zur diagnose von diabetes mellitus
EP2478377A2 (de) Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung vaskulärer erkrankungen
WO2009047280A2 (de) Polypeptidmarker zur diagnose von prostatakrebs
WO2007000466A1 (de) Polypeptidmarker zur frühzeitigen erkennung der rejektion von transplantierten nieren
EP1784649B1 (de) Polypeptidmarker zur diagnose von arteriosklerose
WO2006106115A2 (de) Polypeptidmarker zur diagnose von alzheimer
WO2013150132A2 (de) Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung von schlaganfällen
WO2012076723A1 (de) Verfahren und marker zur diagnose einer gallengangsstriktur und eines cholangiozellulären karzinoms im gallensaft
WO2007063089A2 (de) Polypeptidmarker zur diagnostik und beurteilung vaskulären erkrankungen

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09796710

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13140106

Country of ref document: US

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2009796710

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009796710

Country of ref document: EP