DE60037012T2

DE60037012T2 - Inhibitoren der endothelin-1 synthese

Info

Publication number: DE60037012T2
Application number: DE60037012T
Authority: DE
Inventors: Roger Corder; Adrian P. L. Smith; Timothy W. Higenbottam; Martine Silver Spring ROTHBLATT; Sir John William Harvey Research Ins VANE; Delphine Dominique Lees
Original assignee: Queen Mary and Westfiled College University of London
Current assignee: Queen Mary University of London
Priority date: 1999-03-18
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2020-03-18
Also published as: EP1163333A2; EP1163333B1; ES2296613T3; WO2000055314A9; ATE377645T1; US7423141B2; WO2000055314A3; AU3934000A; WO2000055314A2; PT1163333E; US20030109480A1; DE60037012D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Sequenzen in humaner Präproendothelin-1-mRNA, gegen welche Antisense-Oligonukleotide verwendet werden können, um die Synthese von Endothelin-1 zu inhibieren. Die Erfindung betrifft auch die Behandlung von Krankheiten, bei welchen eine überschüssige Produktion von Endothelin-1 eine zugrunde liegende Ursache der Symptome ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Endothelin-1 (ET-1) ist ein Peptid mit 21 Aminosäuren, das aus dem konditionierten Medium gezüchteter Endothelzellen isoliert ist. Nachfolgende Studien zeigten, dass es in Endothelzellen, Epithelzellen und in sowohl vaskulären als auch nicht-vaskulären Zellen der glatten Muskulatur synthetisiert wird. Es ist das stärkste Vasokonstriktor-Mittel, das je identifiziert wurde, und bewirkt eine Vasokonstriktion in den meisten, wenn nicht in allen Gefäßbetten. Endothelin-1 hat eine Reihe anderer Wirkungen, einschließlich einer Förderung der Mitogenese der glatten Muskulatur, die bei den zugrunde liegenden pathologischen Prozessen einer Vielfalt von Krankheiten gleichermaßen wichtig oder sogar noch wichtiger sein kann (Hages und Webb, 1998).
Zu den akuten Auswirkungen von Endothelin-1 in den Atemwegen und im pulmonalen Gefäßsystem zählen die pulmonale Arterien- und Venen-Vasokonstriktion, Extravasation und Ödem-Bildung und Bronchokonstriktion. Aktuelle Beweise lassen jedoch darauf schließen, dass, wenn die Expression von Endothelin-1 ungeregelt ist, seine Beteiligung an chronischen Veränderungen genauso wichtig sein kann wie jede akute gefäßverengende Wirkung. Dies trifft besonders für das pulmonale Gefäßsystem und die Atemwege zu, wo Endothelin-1 eine langfristige Rolle bei der Remodellierung durch Förderung der Mitogenese der glatten vaskulären und trachealen Muskulatur und bei der Stimulierung der Kollagensynthese durch pulmonale Fibroblasten spielen kann.
Aktuelle Ansätze zur Inhibierung von ET-1 konzentrierten sich vor allem auf die Entwicklung von Antagonisten, doch haben diese systemische Wirkungen, die für den Lungenkreislauf schädlich sind (z. B. periphere Hypotonie). Außerdem gibt es mindestens zwei Endothelin-Rezeptor-Subtypen, nämlich den Subtyp Endothelin-A (ETA) und den Subtyp Endothelin-B (ETB). Beide scheinen an der Vermittlung von Vasokonstriktor-Antworten auf Endothelin im pulmonalen Gefäßsystem beteiligt zu sein (McCulloch et al., 1998). Der Subtyp Endothelin-B ist aber auch ein Clearance-Rezeptor, so dass Mittel, die ihn blockieren, die zirkulierenden ET-1-Mengen erhöhen (Loffler et al., 1993, und Fukuroda et al., 1994) und die Wirksamkeit des Antagnonismus verringern können.
Die WO-A-99/11778 offenbart gegen ET-1 gerichtete Antisense-Oligonukleotide bei der Behandlung der pulmonalen Hypertonie.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung ist ein Antisense-Oligonukleotid vorgesehen, das zur humanen Präproendothelin-1-mRNA komplementär ist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus WH11 und WH11A, welche Nukleinsäuresequenzen wie folgt:
oder ein Phosphorthioat-Derivat, ein Methylphosphonat-Derivat, ein Phosphoramidat-Derivat, ein Amid-Derivat oder ein Boranophosphat-Derivat davon aufweisen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutisch wirksame Menge einer mindestens ein Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1 aufweisenden Zusammensetzung zur Verwendung bei der Reduktion der Endothelin-1-Synthese vorgesehen. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung kann das mindestens eine Antisense-Oligonukleotid zur Verabreichung in die Lunge dienen.
Die das Antisense-Oligonkleotid umfassende Zusammensetzung kann weiters mindestens einen Arzneistoff aufweisen, der die Vasokonstriktion inhibiert. Der Arzneistoff kann ein Prostaglandin, ein Prostaglandin-Analog, ein Calcium-Kanalblocker, Adenosin oder ein Adenosin-Analog sein. Zweckmäßig kann der Arzneistoff 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ oder ein Prodrug-Analog von 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ sein.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Lungenkrankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bronchiolitis obliterans, Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung vorgesehen.
Gemäß einem vierten Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids gemäß dem ersten Aspekt bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pulmonaler Hypertonie vorgesehen.
Gemäß einem fünften Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem Antisense-Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus WH11 und WH11A, welche Nukleinsäuresequenzen wie folgt:
oder ein Phosphorthioat-Derivat, ein Methylphosphonat-Derivat, ein Phosphoramidat-Derivat, ein Amid-Derivat oder ein Boranophosphat-Derivat davon aufweist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, der das mindestens eine Antisense-Oligonukleotid an die Lunge abgeben kann. Der Träger kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus einem Aerosol oder einem Pulver. Die Zusammensetzung kann weiters mindestens ein Medikament umfassen, das die Vasokonstriktion inhibiert. Der Arzneistoff kann Prostaglandin, ein Prostaglandin-Analog, ein Calcium-Kanalblocker, Adenosin oder ein Adenosin-Analog sein. Zweckmäßig kann der Arzneistoff 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ oder ein Prodrug-Analog von 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ZEICHNUNGEN
1(a)–1(c) veranschaulichen die Wirkung von (a) 200 nM, (b) 300 nM und (c) 400 nM Antisense-Oligonukleotid auf die ET-1-Synthese in der Endothel-Zelllinie EA.hy 926. Die Ergebnisse stammen von zwei Versuchen mit n = 6 für jede Behandlung. * zeigt eine signifikant verringerte ET-1-Synthese, p < 0,001, im Vergleich zu den Werten für das Kontroll-Antisense-Oligonukleotid an. Die x-Achsen der 1(a) und 1(b) sind identisch mit der x-Achse der 1(c).
2(a)–2(c) veranschaulichen die Wirkung von (a) 200 nM, (b) 300 nM und (c) 400 nM Antisense-Oligonukleotid auf die ET-1-Synthese in der Epithel-Zellinie A549. Die Ergebnisse stammen von zwei Versuchen mit n = 6 für jede Behandlung, außer (c), wo n = 9–11. * zeigt eine signifikant verringerte ET-1-Synthese, p < 0,01, im Vergleich zu den Werten für das Kontroll-Antisense-Oligonukleotid an. Die x-Achsen der 2(a) und 2(b) sind identisch mit der x-Achse der 2(c).
Die 3(a)–3(b) veranschaulichen die Wirkung von 300 nM Antisense-Oligonukleotid auf die ET-1-Synthese von 24–48 h nach Transfektion in (a) A549-Zellen und (b) EA.hy 926-Zellen. Nach der Transfektion mit ASON wurden Zellen in vollständigem Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum, 24 h lang vor dem Untersuchungszeitraum gezüchtet. Die Ergebnisse stammen von Versuchen für A549 (n = jeweils 8) und von drei Versuchen für EA.hy 926 (n = jeweils 12). * zeigt eine signifikant verringerte ET-1-Synthese, p < 0,001, im Vergleich zu den Werten für das Kontroll-Antisense-Oligonukleotid an. Die x-Achse der 3(a) ist identisch mit der x-Achse der 3(b).
Die 4(a)–4(b) veranschaulichen die Wirkung einer Kombination anderer Antisense-Oligonukleotide mit S1. Die kombinierte Konzentration von S1 mit anderen Oligonukleotiden war in jedem Fall 300 nM. Die ET-1-Synthese wurde von 24–48 h nach Transfektion in (a) A549-Zellen und (b) EA.hy 926-Zellen untersucht. Die Ergebnisse stammen aus zwei Versuchen für A549 und EA.hy 926 (n = jeweils 8). * zeigt eine signifikant verringerte ET-1-Synthese, p < 0,001, im Vergleich zu den Werten für das Kontroll-Antisense-Oligonukleotid alleine an. Die x-Achse der 4(a) ist identisch mit der x-Achse der 4(b).
Die 5(a)–5(b) veranschaulichen die Wirkung von neuen Antisense-Oligonukleotiden bei 300 nM und 400 nM auf die ET-1-Synthese. Der Untersuchungszeitraum war zuerst 24 h nach der Transfektion für (a) A549-Zellen und (b) EA.hy 926-Zellen. Die Ergebnisse stammen von zwei Versuchen mit jeder Konzentration für A549 und EA.hy 926 (n = 6/7 für jede Behandlung), * zeigt eine signifikant verringerte ET-1-Synthese, p < 0,001 + p < 0,05, im Vergleich zu den Werten für das Kontroll-Antisense-Oligonukleotid an. Die x-Achse der 5(a) ist identisch mit der x-Achse der 5(b).
6 zeigt die Wirkung von 400 nM Antisense-Oligonukleotid auf die ET-1-Synthese, gemessen über die ersten 24 h nach Transfektion in (a) A549-Zellen und (b) EA.hy 926-Zellen. Die rechten Tafeln zeigen relative mRNA für Präproendothelin-1/GAPDH aus Zellen, die am Ende des 24 h-Inkubationszeitraums geerntet wurden. Die Ergebnisse stammen aus einem Versuch für A549 und EA.hy (n = 3 für jede Behandlung), * zeigt signifikante Reduktionen, p < 0,05, im Vergleich zu den Werten für das Kontroll-Oligonukleotid an.
7 ist ein Vergleich der Wirkung von 400 nM Präproendothelin-Antisense-Oligonukleotiden auf die ET-1-Synthese und Adrenomedullin-Synthese in (a) A549-Zellen und (b) EA.hy 926-Zellen. Die Werte sind als % der Freisetzung in Anwesenheit eines Kontroll-Antisense-Oligonukleotids ausgedrückt.
8(a)–8(b) zeigen die Wirkung der Modifizierung der Länge der aktiven Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotide WH10, WH11 und S1 (20-mere). Vergleich der ET-1- und Adrenomedullin-Synthese durch A549- und EA.hy 926-Zellen. Nach einstündiger Transfektion und vierstündiger Gewinnung in vollständigem Medium wurden die Wirkungen auf die ET-1-Synthese während der folgenden 24 h bestimmt. Die Ergebnisse stammen von zwei Versuchen (n = jeweils 6). A und B sind 18-mere; C, D und E sind 16-mere (vgl. 17), alle wurden bei 300 nM getestet.
9(a)–9(b) zeigen die Wirkung von Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotiden (300 nM), die auf die 5'-nicht-codierende Region von Präproendothelin-1-mRNA abzielen. Signifikante Verringerungen der ET-1-Synthese wurden sowohl mit A549- als auch mit EA.hy 926-Zellen erreicht, ohne die Adrenomedullin-Produktion zu verändern. Nach einstündiger Transfektion und vierstündiger Gewinnung in vollständigem Medium wurden die Wirkungen auf die ET-1-Synthese während der folgenden 24 h bestimmt. Die Ergebnisse stammen von zwei Versuchen (n = jeweils 6).
10(a)–10(b) zeigen die Wirkung von Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotiden (300 nM), die auf die Exon-Intron-Spleißstellen des primären RNA-Iranskripts von Präproendothelin-1 abzielen. Vergleich der ET-1- und Adrenomedullin-Synthese durch A549 und EA.Hy 926-Zellen. Nach einstündiger Transfektion und vierstündiger Gewinnung in vollständigem Medium wurden die Wirkungen auf die ET-1-Synthese während der folgenden 24 h bestimmt. Die Ergebnisse stammen von zwei Versuchen (n = jeweils 6). * zeigt p < 0,01 im Vergleich zum Kontroll-Oligonukleotid an.
11(a)–11(b) zeigen einen Vergleich von 18-meren Phosphorthioat-ASON (WH20A, WH20B, WH20C, WH21A, WH21B, WH29A, WH29B, WH31A und WH31B) mit entsprechenden 20-meren Phosphorthioat-ASON (WH20, WH21, WH29 und WH31) in Bezug auf (a) ET-1-Freisetzung und (b) Adrenomedullin-Freisetzung aus EA.hy 926- Zellen und A549-Zellen. Die ASON-Konzentration war jeweils 200 nM.
12(a)–12(b) zeigen die Wirkung von ASON alleine oder in Kombination auf die ET-1-Synthese durch EA-hy 926 und A549 24–48 h nach Transfektion mit Oligonukleotid. Nach Transfektion mit ASON wurden die Zellen in vollständigem Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum, 24 h lang vor dem Untersuchungszeitraum gezüchtet. Für jeden Zustand ist die Endkonzentration 300 nM Phosphorthioat-Oligonukleotid, paarweise Kombinationen sind 150 nM von jedem, die dreifache Kombination ist 100 nM von jedem. Die Ergebnisse sind n = jeweils 6. * zeigt eine signifikant reduzierte ET-1-Synthese im Vergleich zu Kontroll-ASON an. Die x-Achse der 12(a) ist mit der x-Achse der 12(b) identisch.
13 zeigt die Wirkung verschiedener ASON-Kombinationen (25 nM von jedem ASON, insgesamt 150 nM) auf die ET-1-Freisetzung aus EA.hy 926-Zellen. Vergleich mit 150 nM WH11A oder 150 nM Kontroll-ASON.
14 zeigt die Wirkung verschiedener ASON-Kombinationen (25 nM von jedem ASON, insgesamt 150 nM) auf die Adrenomedulllin-Freisetzung aus EA-hy 926-Zellen. Vergleich mit 150 nM WH11A oder 150 nM Kontroll-ASON.
15 zeigt die Wirkung verschiedener ASON-Kombinationen (25 nM von jedem ASON, insgesamt 150 nM) auf die ET-1-Freisetzung aus A549-Zellen. Vergleich mit 150 nM WH11A oder 150 nM Kontroll-ASON.
16 zeigt die Wirkung verschiedener ASON-Kombinationen (25 nM von jedem ASON, insgesamt 150 nM) auf die Adrenomedullin-Freisetzung aus A549-Zellen. Vergleich mit 150 nM WH11A oder 150 nM Kontroll-ASON.
17–19 veranschaulichen Sequenzen verschiedener ASON, einschließlich der WH11- und WH11A-Sequenzen gemäß der Erfindung.
17 zeigt den Ort der Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen in der 5'-Sequenz von Präproendothelin-1-mRNA. Unterstrichene Sequenzen stellen ASON dar, die eine > 35% Inhibierung der ET-1-Synthese auf A549- und EA.hy 526-Zellen zeigen, wenn sie bei 300 nM getestet werden.
18 zeigt (a) die Aminosäure- und (b) die cDNA-Sequenz von Präproendothelin-1-mRNA. Die ganze Nummerierung basiert auf der Sequenz, die in Genbank, Hinterlegungsnummer Y00749 berichtet ist.
19 zeigt Antisense-Oligonukleotid-Sequenzen.
Wie in der vorliegenden Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet, inkludieren – sofern nicht anders angegeben – die Ausdrücke „Oligonukleotid", „Antisense-Oligonukleotid" oder „ASON" (bedeutet Antisense-Oligonukleotid) sowohl Oligomere von Ribonukleotid, d. h. Oligoribonukleotide, und Oligomere von Desoxiribonukleotid, d. h. Oligodesoxyribonukleotide (hierin auch als „Oligodesoxynukleotide" bezeichnet). Oligodesoxynukleotide sind bevorzugt.
Wie hierin verwendet, inkludiert – sofern nicht anders angegeben – der Ausdruck „Oligonukleotid" auch Oligomere, die groß genug sein können, um sie als „Polynukleotide" zu bezeichnen.
Ein Antisense-Oligonukleotid, wie in den Patentansprüchen definiert, wird verwendet, welches auf die 5'-untranslatierte Region von humaner mRNA, die mit Präproendothelin-1 verbunden ist, abzielt. Der Durchschnittsfachmann weiß, dass mRNA nicht nur die Codierregion inkludiert, die die Information zum Codieren eines Proteins trägt, wobei der Dreibuchastaben-Gen-Code verwendet wird, sondern auch assoziierte Ribonukleotide, die eine Region bilden, die bekannt ist als die translatierte Region, die 3'-untranslatierte Region, die 5'-cap-Region, Intron-Regionen und Intron/Exon oder Spleißkontaktstellen(„splice junction")-Ribonukleotide. Die Funktionen der Messenger-RNA, in die eingegriffen werden soll, umfassen alle lebenswichtigen Funktionen, wie Translokation der RNA an die Stelle für eine Protein-Translation, tatsächliche Translation des Proteins aus der RNA, Spleißen oder Reifung der RNA und gegebenenfalls sogar eine unabhängige katalytische Aktivität, mit welcher die RNA befasst sein kann. Die Gesamtwirkung eines solchen Eingreifens in die RNA-Funktion ist es, eine Störung der Präproendothelin-1-Protein-Expression zu bewirken und dadurch die Synthese von Endothelin-1 zu inhibieren.
Der Ausdruck „entsprechen" bedeutet, dass die bestimmte Verbindung Basenpaarungs-Charakteristika hat, die mit der Nukleinsäuresequenz, auf die Bezug genommen wird, vergleichbar sind, d. h., vergleichbare Hybridisierungs-Charakteristika.
„Hybridisierung” bedeutet im Zusammenhang mit dieser Erfindung eine Wasserstoffbindung, auch als Watson-Crick-Basenpaarung bekannt, zwischen komplementären Basen, üblicherweise an entgegengesetzten Nukleinsäure-Strängen oder zwei Regionen eines Nukleinsäure-Strangs. Guanin und Cytosin sind Beispiele für komplementäre Basen, von welchen bekannt ist, dass sie drei Wasserstoffbindungen zwischen sich bilden. Adenin und Thymin oder Adenin und Uracil sind Beispiele für komplementäre Basen, die zwei Wasserstoffbindungen zwischen sich bilden. „spezifisch hybridisierbar" und „komplementär" sind Ausdrücke, die verwendet werden, um einen ausreichenden Grad an Komplementärität anzugeben, so dass eine stabile und spezifische Bindung zwischen der DNA und dem RNA-Ziel und dem Oligonukleotid erfolgt. Man versteht, dass ein Oligonukleotid nicht 100% komplementär zu seiner Ziel-Nukleinsäuresequenz sein muss, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Ein Oligonukleotid ist spezifisch hybridisierbar, wenn die Bindung des Oligonukleotids an das Ziel in die zuvor unbeeinflusste Funktion des Ziel-Moleküls eingreift, um einen Verlust seiner Wirksamkeit zu bewirken, und ein ausreichender Grad an Komplemtarität besteht, um eine unspezifische Bindung des Oligonukleotids an Nicht-Ziel-Sequenzen unter Bedingungen, unter welchen eine spezifische Bindung erwünscht ist, zu vermeiden, d. h. unter physiologischen Bedingungen im Fall einer in vivo-Anwendung oder einer therapeutischen Behandlung (oder im Fall von in vitro-Tests unter Bedingungen, unter welchen die Tests durchgeführt werden).
Die Ausdrücke „Oligonukleotid", „Oligodesoxynukleotid", „Antisense-Oligonukleotid" und „Antisense-Oligodesoxynukleotid" inkludieren nicht nur Oligomere und Polymere der allgemein biologisch signifikanten Nukleotide, d. h. der Nukleotide Adenin („A"), Desoxyadenin („dA"), Guanin („G"), Desoxyguanin („dG"), Cytosin („C"), Desoxycytosin („dC"), Thymin („T") und Uracil („U"), sondern umfassen auch Oligomere und Polymere, die mit dem Präproendothelin-1-mRNA-Transkript hybridisierbar sind, welches andere Nukleotide enthalten kann, wie 5-Propynyluracil, 5-Methylcytosin, 5-Propynylcytosin, Adenin und 2-Aminoadenin.
Der Ausdruck „Phosphothioat-Oligonukleotid" bedeutet ein Oligonukleotid, worin eine oder mehrere der Internukleotid-Verbindungen eine Phosphorthioat-Gruppe
ist, im Gegensatz zur Phosphodiester-Gruppe
welche für unmodifizierte Oligonukleotide charakteristisch ist.
Phosphorthioat umfasst im weiteren Sinn auch andere Arten, wie Phosphordithioat, Sulfat, Sulfonat, Sulfonamid, Sulfon, Sulfit, Sulfoxid, Sulfid, Formacetal, 3-Thioformacetal, 5'-Thioehter, Hydroxylamin (mit CH.sub.2-NH-O-CH.sub.2 anstelle der Phosphodiesterbindung O → (HO-)P(.dbd.O)!-O-CH.sub.2), Methylen(-methylimino) (mit CH.sub.-N(CH.sub.3)-O-CH.sub.3 anstelle der Phosphodiester-Bindung); Methylenoxy(-methylimino) (mit (CH.sub.2-O-N(CH.sub.3)-CH.sub.2 anstelle der Phosphodiester-Bindung), Methylen-((methylimino)-methylimino) (mit CH.sub.2-N(CH.sub.3)-N(CH.sub.3)-CH.sub.2 anstelle der Phosphodiester-Bindung), Carbonat, 5'-N-Carbamat, Amid (mit CH.sub.2-(C.dbd.O)-NH-CH.sub.2 anstelle der Phosphodiester-Bindung, vgl. die internationale Anmeldung WO 92/20823 ), Morpholino-carbamat (vgl. Summerton, J. E. und Weller, D. D., U.S. Pat. Nr. 5,034,506 ), oder Peptid-Nukleinsäure (vgl. P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science 254, 1497 (1991)), die zur Verwendung auf dem Gebiet bekannt sind (für einen Überblick mit Literaturstellen bezüglich dieser modifizierten Nukleotide, siehe Milligan et al., J. Med. Chem. 36(14), 1923–37 (1993), und Uhlmann et al., Chemical Reviews 90(4), 543–84 (1990)). Gemäß einiger bevorzugter Ausführungsformen wurde mindestens eine der Phosphodiester-Bindungen des Oligonukleotids durch eine Struktur substituiert, die die Funktion hat, die Fähigkeit der Zusammenensetzungen zu verbessern, in jene Region der Zellen einzudringen, wo sich die RNA oder DNA, deren Aktivität zu modulieren ist, befindet, und um einen umfangreichen Abbau des Oligonukleotid-Derivats infolge von Nukleasen, die zu unwirksamen Spaltprodukten führen würden, zu vermeiden. Solche Substitutionen umfassen Phosphorthioat-Bindungen, Phosphordithioat-Bindungen, Methylphosphonat-Bindungen, Phosphoramidat-Bindungen, Amid-Bindungen, Boranphosphat-Bindungen und Phosphotriester-Bindungen.
Mit „Alkylphosphonat-Oligonukleosid" ist ein Oligonukleotid gemeint, worin eine oder mehrere der Internukleotid-Verbindungen eine Alkylphosphonat-Gruppe
ist, worin R Methyl ist.
„Analoga" in Bezug auf Nukleoside umfasst synthetische Nukleoside mit modifizierten Basen-Anteilen und/oder modifizierten Zucker-Anteilen, z. B. allgemein von Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980) beschrieben. Solche Analoga umfassen synthetische Nukleoside, die zur Verbesserung der Bindungseigenschaften, z. B. Duplex- oder Triplex-Stabilität, Spezifität od. dgl., entworfen sind.
Eine Aminosäuren- und cDNA-Sequenz von humaner Präproendothelin-1-mRNA ist in 8 veranschaulicht, wie in FEBS Lett. 231 (2), 440–444 (1988) geoffenbart. Alle Nummern der humanen Präproendothelin-1-mRNA basieren auf der Sequenz-Nummerierung der Genbank Hinterlegungsnummer Y00749. Die „5'-untranslatierte Region" oder „5'-untranslatierte Region der humanen Präproendothelin-1-mRNA" definiert die Basen von 1–253 der Präproendothelin-1-mRNA.
Der Ausdruck „inhibieren" bedeutet, die Präproendothelin-1-Synthese reduzieren und daher auch die Sekretion oder Freisetzung von Endothelin-1 reduzieren.
„EA.hy 926-Zelllinie" bedeutet die von Edgell und Kollegen beschriebene Zelllinie [Edgell C-J.S., McDonald CC und Graham JP. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80: 3734–3737]. Diese Zelllinie wurde durch Fusionieren von humanen Endothelzellen der Nabelvene mit A549-Zellen hergestellt. Eine Reihe von Studien zeigte, dass die resultierende EA.hy 926-Zelllinie die Merkmale der Endothelzellen, einschließlich der Synthese von Endothelin-1, beibehält [Corder R., Khan N. & Harrison V. J. A simple method for isolating human endothe lin converting enzyme (ECE-1) free from contamination by neutral endopeptidase 24.11. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995, 207: 355–362].
„A549-Zelllinie" bedeutet die Zelllinie der American Type Culture Collection (ATCC CCL-185). Ursprünglich von einem humanen Lungenkarzinom abstammend, weist sie morphologisch Epithelartige Merkmale auf.
Der Ausdruck „Transfektionsmittel" bedeutet das Reagens, das verwendet wird, um die Antisense-Oligonukleotide an Zellen zu liefern. Im Allgemeinen bestehend aus kationischem Lipid und neutralem Lipid, bildet das Transfektionsmittel Liposome mit den Oligonukleotiden in wässeriger Lösung. Die resultierenden Liposome sind Träger, um die Oligonukleotide in Zellen zu transferieren.
Der Ausdruck „Remodellieren" bedeutet eine Veränderung der Struktur der Atemwege oder Blutgefäße, die allgemein mit einer Zunahme der Zellen der glatten Muskulatur entweder alleine oder zusammen mit einer erhöhten Menge der extrazellulären Matrix verbunden ist. Der Ausdruck „obstruktive Luftweg-Erkrankung" kann auch „chonisch-obstruktive Lungenerkrankung" bedeuten.
Dosierungsmengen, Formen, Häufigkeit und Dauer der Wirkung
Die Dosierungsmengen der vorliegenden Erfindung, wie in den Patentansprüchen definiert, umfassen – jedoch ohne Einschränkung darauf – von 0,01 bis 50 mg/kg Träger mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge an Antisense, die an die Lunge als trockenes Pulver oder Aerosol abgegeben wird. Eine andere Ausführungsform dieses Bereichs ist von 1 bis 10 mg/kg.
Die Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, wie in den Patentansprüchen definiert, können auf die Lunge mit unterschiedlicher Häufigkeit und für eine unterschiedliche Zeitdauer aufgebracht werden. In dieser Hinsicht weiß der Fachmann, wie man die Häufigkeit und die Dauer der Anwendung zum Erreichen der gewünschten Wirkung verändern soll. Beispielsweise können die Antisense-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung mit unterschiedlicher Häufigkeit genommen werden, einschließlich täglich, oder ein oder mehrere Male täglich. Bei täglicher Anwendung kann die vorliegende Erfindung 1, 2, 3 oder mehrere Male pro Tag genommen werden. Die Dauer der Behandlung mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann auch variieren. Zum Beispiel können die Zusammensetzungen 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Wochen lang; oder 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Monate lang angewendet werden. Die Behandlungsdauer kann auch kontinuierlich sein. Wiederum wird der Fachmann das Zusammenwirken zwischen Häufigkeit und Dauer der Verwendung kennen, um die gewünschte Wirkung zu erreichen und/oder beizubehalten.
Zusätzlich wird der Fachmann wissen, wie man die Konzentrationen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit der Häufigkeit und Dauer der Verwendung variiert, um die gewünschte Wirkung zu erreichen. Beispielsweise könnten die Antisense-Oligonukleotide in einer Zusammensetzung höherer Konzentration weniger oft oder für eine kürzere Zeitdauer angewendet werden. Dagegen könnten Antisense-Oligonukleotide mit geringerer Konzentration häufiger oder für eine längere Zeitdauer angewendet werden.
Außerdem wird der Fachmann wissen, wie die Wirkungsdauer der Antisense-Oligonukleotide varriert. Die Wirkungsdauer kann für die Oligonukleotide so variiert werden, dass sie für eine Zeitdauer wie 1–48 Stunden, 4–24 Stunden, 6–18 Stunden oder 6–12 Stunden wirksam sind, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein.
Synthese von Antisense-Oligonukleotiden
Die ASON wurden unter Verwendung von Standardmethoden auf einem automatischen Oligonukleotid-Synthesizer den Kundenwünschen entsprechend synthetisiert und danach mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie gereinigt.
Zum Testen verwendete Zellkulturen
Das Testen von ASON an gezüchteten Zellen erfolgte unter Verwendung von humanen Endothel-(EA.hy 926-Zelllinie) und Epithel(A549)-Zelllinien. Die Zellen wurden gezüchtet, bis sie 50–70% konfluent waren, und danach 1 h lang in serumfreiem Medium, das die ASON in den angegebenen Konzentrationen enthielt, behandelt, gegebenenfalls mit einer geeigneten Konzentration eines Transfektionsmittels (Transfast, Promega). Die Zellen wurden dann in vollständiges Medium, das 10% fötales Rinderserum enthielt, für 4 h zurückgegeben. An diesem Punkt wurde das Medium durch serumfreies Medium ersetzt, und die Zellen wurden 24 h lang inkubiert, um die ET-1-Synthese zu untersuchen. Bei einigen Studien wurde die Zeitdauer mit 10% fötalem Rinderserum auf 24 h erhöht, und die Endothelin-1-Synthese wurde von 24 h bis 48 h lang untersucht. Am Ende der Inkubationsdauer wurde das konditionierte Medium für den nachfolgenden ET-1-Test gesammelt. Um die Lebensfähigkeit der Zellen und die unspezifische Zytotoxizität zu messen, wurde ein MTT-Test (eine Schätzung der lebenden Zellen auf Basis der Mitochondrien-Dehydrogenase-Aktivität) durchgeführt. Die ET-1-Synthese wurde mit einem empfindlichen Sandwich-Immunoassay und danach für jede Vertiefung, die auf den MTT-Wert normalisiert worden war, gemessen. Ein statistischer Vergleich wurde mit den Wirkungen eines Kontroll-Oligonukleotids anhand von ANOVA mit dem LSD-Test von Fischer durchgeführt. Bei allen Studien wurden weiterhin die Wirkungen von ASON auf humane Endothel-(EA.hy 926-Zelllinie)- und Epithel(A549)-Zelllinien nach Behandlung der sub-konfluenten Kulturen mit ASON in Anwesenheit eines Transfektionsmittels (Transfast, Promega) verglichen.
Nach den anfänglichen Evaluierungen (1–4), um andere aktive ASON zu entwerfen, wurde die sekundäre Struktur von humaner preproET-1-mRNA unter Verwendung von „MFOLD" (dem Energie-Minimierungsprogramm-Algorithmus von Zuker) erneut evaluiert. Auf Basis dieser Analyse war S1 die einzige Sequenz, wo die 5'-Sequenz für eine 3'-Bindung des ASON zugänglich war. Daher wurde eine Anzahl von neuen ASON entworfen, die ebenfalls dieses Kriterium erfüllten (WH7 bis WH14). S8 ist homolog zu S1, eine Base 5' verschoben, um zu sehen, ob dies seine Aktivität veränderte, da die sekundäre Struktur-Vorhersage anzeigte, dass dies seine Bindung einschränken könnte. Aus Studien zur Identifizierung von Ziel-Sequenzen, um ASON gegen für eine Inhibierung der ET-1-Synthese zu lenken, wurden sechs Regionen der 5'-nicht-codierenden Sequenz von Präproendothelin-1-mRNA ohne jegliche Überlappung (d. h. WH20/21, WH10, WH11, S1, WH29 und WH31) definiert. Die Evaluierung der humanen Genom-Datenbank hat bisher nicht angezeigt, dass diese Sequenzen besonders homolog mit anderen Gen-Sequenzen sind, was nahelegt, dass sie relativ frei von unspezifischen Wirkungen sein sollten.
Adrenomedullin-Test
Ein empfindlicher "Sandwich"-Immunoassay für Adrenomedullin mit doppelten Erkennungsstellen wurde entwickelt, so dass es als Kontroll-Gen in diesen Studien gemessen werden kann. Der Test wird in einem Format mit einer Platte mit 96 Vertiefungen durchgeführt, wobei Platten verwendet wurden, die mit Kaninchen-IgG, das für den N-Terminus von Adrenomedullin spezifisch ist, vorbeschichtet werden. Der Test umfasst eine Über-Nacht-Inkubation einer Probe oder eines Standards mit biotinyliertem Schaf-IgG, das für den C-Terminus von Adrenomedullin spezifisch ist. Gebundenes C-terminales IgG wird nachgewiesen durch Durchführen einer weiteren Inkubation mit ¹²⁵I-Streptavidin, gefolgt von einer Zählung. Das gebundene ¹²⁵I ist proportional zur Adrenomedullin-Konzentration, für welche der Testbereich 1 zu 1000 fmol/ml ist.
Exon-Intron-Antisense-Oligonukleotide
Die Wirkung von ASON, die auf Exon-Intron-Spleißstellen im primären Transkript des Präproendothelin-1-Gens abzielen, wurden evaluiert und mit S1 verglichen (4). Die getesteten Antisense-Oligonukleotide waren WH34 (= 3'-Spleißstelle von Exon-1); (WH35 = 5'-Spleißstelle von Exon-2); WH36 (= 3'-Spleißstelle von Exon-2); WH37 (= 5'-Spleißstelle von Exon-3); WH38 (= 3'-Spleißstelle von Exon-3); WH39 (= 5'-Spleißstelle von Exon-4); WH40 (= 3'-Spleißstelle von Exon-4) und WH41 (= 5'-Spleißstelle von Exon-5). Nach einstündiger Transfektion und vierstündiger Gewinnung in vollständigem Medium wurden die Wirkungen auf die ET-1-Synthese über die folgenden 24 h bestimmt.
WH34, WH35, WH36, WH37, WH38, WH39 und WH41 zeigten eine signifikante Inhibition der ET-1-Synthese, ohne die Adrenomedullin-Synthese signifikant zu reduzieren. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass das Ziel für die ASON-Moleküle primäre RNA-Transkripte vor dem Prozessieren zu mRNA sowie die mRNA selbst inkludiert.
Wirkung von Kombinationen von ASON auf Reduktionen der ET-1-Synthese
Test (A)
Die aktiven ASON S1, WH10 und WH11 sind alle komplementär zu Sequenzen in der 5'-untranslatierten Region von humaner prepro-ET-1-mRNA. Um zu testen, ob die Kombination verschiedener aktiver ASON den Grad der Inhibition der Et-1-Synthese erhöhen könnte, wurden die Auswirkungen des Kombinierens dieser ASON getestet. Die getesteten Kombinationen waren [S1 + WH10], [WH10 + WH11] und [S1 + WH10 + WH11]. EA.hy 926- und A549-Zellen wurden eine Stunde lang mit ASON in den angegebenen Kombinationen transfiziert und 24 h lang in vollständigem Medium gezüchtet. Die ET-1-Freisetzung wurde dann von 24–48 h untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombination von ASON möglicherweise eine stärkere Wirkung auf die ET-1-Synthese erreichen kann als die Verwendung einzelner ASON (10).
Test (B)
Um zu evaluieren, ob die verschiedenen ASON als Kombinationen verwendet werden könnten, wurden Tests an EA.hy 926- und A549-Zellen durchgeführt, wobei die wirksamsten 18-meren Phosphorthioat-ASON verwendet wurden, die auf sechs Sequenzen der 5'-untranslatierten Region von Präproendothelin-1-mRNA abzielten. Zu den gleichzeitigen Vergleichen, die vorgenommen wurden, zählten die Beurteilung, ob es größere Unterschiede in der Inhibierung der ET-1-Synthese gab für: WH20A vs. WH20C vs. WH21A; WH10A vs. WH10B; S1A vs. S1B; WH29A vs. WH29B; oder WH31A vs. WH31B. WH11A war in früheren Versuchen wirksamer als WH11B, daher wurde WH11A zur Verwendung bei den Vergleichsstudien der Kombinationen ausgewählt. Bei diesen Versuchen wurden Kombinationen von 6 ASON (25 nM von jedem) mit 150 nM WH11A, oder 150 nM von drei verschiedenen 18meren Kontroll-ASON verglichen. Der Vergleich der Wirksamkeit der verschiedenen Kombinationen auf die Freisetzung von ET-1 und Kontroll-Gen (Adrenomedullin) sind in den 13 bis 16 gezeigt. Alle Kombinationen inhibierten die ET-1-Freisetzung signifikant. Obwohl es keine Kombination gab, die signifikant besser auf beide Zelltypen wirkte, zeigte die statistische Analyse bei beiden Zelllinien, dass Kombinationen mit S1B und WH29B signifikant wirksamer sind als jene mit S1A bzw. WH29A. Zusätzlich wirkten WH10B-enthaltende Kombinationen stärker auf EA.hy 926-Zellen als WH10A, und WH20A war weniger wirksam als entweder WH20C oder WH21A. Auf Basis dieser Analyse sollte die wirksamste Inhibierung mit den folgenden Kombinationen erhalten werden:
[WH20C oder WH21A + WH10B + WH11A + S1B + WH29B + WH31A oder WH31B]; was den Kombinationen 31, 32, 47 und 48 entspricht.
Lungen- und Atemwegserkrankungen können mit der Antisense-Oligonukleotid-Inhibierung von Präproendothelin-1, wie in den Patentansprüchen definiert, behandelt werden. Zu diesen Erkrankungen zählen pulmonale Hypertonie, Bronchiolitis obliterans, chronisch obstruktive Lungenerkrankung und Asthma.
Die medizinische Beherrschung der pulmonalen Hypertonie (PH) ist nur begrenzt erfolgreich, so dass die begleitenden kardialen Veränderungen und die fortschreitende vaskuläre Remodellierung rasch lebensbedrohlich werden. Das Überleben nach der Diagnose ist im allgemeinen weniger als 5 Jahre. In den letzten Jahren wurden die Endotheldysfunktion und die Remodellierung des arte riellen Gefäßsystems zu neuen Zielen für die Behandlung bei einer Vielfalt kardiovaskulärer Erkrankungen. Dies trifft besonders für die pulmonale Hypertonie (PH) zu, die wegen ihrer Renitenz gegenüber der aktuellen Behandlung neuer therapeutischer Ansätze bedarf, um solche Veränderungen unter Kontrolle zu bringen (Marshall und Marshall, 1991, und Riley, 1991).
Unabhängig von der Ursache führt die chronische pulmonale Hypertonie zu verschiedengradiger arterieller Remodellierung mit erhöhtem pulmonalem Gefäßwiederstand und fortschreitendem Rechtsversagen des Herzens. Bei der primären pulmonalen Hypertonie können Steigerungen des Gefäßwiderstands anfänglich auf eine Vasokonstriktion zurückzuführen sein, doch im Laufe der Zeit beginnen die Strukturveränderungen die Lungenarterien zu verstopfen, was eine weitere Erhöhung des Gefäßwiderstands und eine Erhöhung der Wahrscheinlichkeit eines Rechtsversagens des Herzens bewirkt (Marshall und Marschall, 1991, und Riley, 1991). An der Remodellierung sind sowohl die Proliferation der glatten Muskulatur als auch die Bildung von extrazellulären Matrix-Proteinen beteiligt (Marshall und Marshall, 1991, und Riley, 1991). Endothelin-1 wurde als Vermittler der Vasokonstriktion impliziert, und es kann auch die Remodellierung herbeiführen (Hages und Webb, 1998, Di Carlo et al., 1995, Underwood et al., 1998, Underwood et al., 1997, und Chen et al., 1997). Weil an den Vasokonstriktor-Antworten mehr als ein Endothelin-Rezeptor-Subtyp beteiligt ist, kann eine Strategie zur Inhibierung der Endothelin-1-Synthese größere Vorteile bringen als der Versuch, den idealen Antagonisten zu finden, um die Wirkungen des Endothelin-1 im Lungen-Gefäßsystem zu blockieren. Außerdem können Endotehlin-Antagonisten schädliche Auswirkungen haben, indem sie eine Hypotonie im peripheren Gefäßsystem bewirken. Folglich könnten mit einer Behandlung, wie Antisense-Oligonukleotide gegen Präproendothelin-1, das durch Inhalation verabreicht wird, die mit der Spezifität von Antagonisten verbundenen Probleme und ihre nachteiligen Wirkungen überwunden werden. Die Inhalation kann deren Wirkung auf die Luftwege und das Lungen-Gefäßsystem beschränken.
Endothelin-1 (ET-1) erzeugt starke Vasokonstriktor-Wirkungen in allen Gefäßbetten, einschließlich des Lungenkreislaufs. Außerdem stimuliert ET-1 Mitogen-aktivierte Protein-Kinasen (MAPK) und kann die Mitogenese der glatten Muskulatur steigern (Malar key et al., 1995). Klinische und experimentelle Untersuchungen der PH zeigten eine erhöhte Expression und Freisetzung von ET-1 (Giaid und Saleh, 1995, und Nootens et al., 1995). Die Verabreichung der Endothelin-Rezeptor-Antagonisten verringert sowohl den pulmonalen Gefäßwiderstand als auch die mediale Verdickung, die mit PH verbunden sind, welche durch chronische Hypoxie bei Ratten induziert wurde (Di Carlo et al., 1995, Underwood et al., 1998, Underwood et al., 1997, und Chen et al., 1997). Studien zeigten ein umgekehrtes Verhältnis zwischen der Expression von endothelialer Stickoxid-Synthase und der Höhe der ET-1-Immunreaktivität bei PH, was zeigt, dass Erhöhungen des ET-1 ein nützlicher Indikator für eine lokalisierte Endotheldysfunktion sind (Giaid und Saleh, 1995).
Trotz intensiver Foschung sind die Faktoren, die die ET-1-Synthese in vivo regulieren, noch nicht vollständig geklärt. Die meisten Beweise legen jedoch eine Verbindung mit Endothel-Dysfunktion und -Entzündung nahe. Cytokine, einschließlich TNFa, stimulieren die Synthese und Sekretion von ET-1 sowohl in vivo als auch in vitro (Klemm et al., 1995, und Corder et al., 1995). Tatsächlich stimuliert TNFa eine ausreichende ET-1-Freisetzung, um eine Vasokonstriktion zu verursachen (Klemm et al., 1995). Folglich kann die Cytokin-stimulierte ET-1-Synthese eine Schlüsselrolle bei den mit PH verbundenen Prozessen innehaben und kann sowohl für primäre PH als auch für eine PH, die bei anderen Krankheitszuständen auftritt, üblich sein.
Obwohl Bronchiolitis obliterans, Asthma und chronisch-obstruktive Lungenerkrankung verschiedenen Ursprungs sind, weisen alle diese Krankheitszustände verschiedengradige Luftwegs-Remodellierungen auf, was nahelegt, dass es eine gemeinsame zugrundeliegende Ursache geben könnte. Diese Krankheitszustände sind gekennzeichnet durch eine Entzündung mit einer Proliferation der Zellen der glatten Muskulatur und Fibrose, die zur Obstruktion der Luftwege führt. Der genaue Ort der Remodellierung kann je nach der Krankheit die oberen oder unteren Atemwege sein. Im Allgemeinen gilt, je weiter fortgeschritten die Krankheit ist, desto stärker ist die Remodellierung. Eine erhöhte Endothelin-1-Expression wurde bei diesen Krankheiten identifiziert, und dies kann mit der Remodellierung in Verbindung stehen, weil Endothelin-1 die Mitogenese der glatten Muskulatur der Luftwege und von Fibroblasten stimuliert und die Produktion extrazellulärer Ma trix induziert. Außerdem induziert Endothelin-1 die Bronchokonstriktion, was diese Krankheiten weiter verschlechtern kann. Studien, die die diese Wirkungen vermittelnden Rezeptor-Subtypen charakterisieren, zeigten, dass Endothelin-A, Endothelin-B und ein putativer neuer Subtyp des Endothelin-Rezeptors eine Rolle spielen. Folglich kann die Inhibierung der Endothelin-1-Synthese unter Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden für Präproendothelin-1 einen therapeutischen Nutzen haben, der mit aktuellen Therapien nicht erreichbar ist. Bei der Behandlung von Bronchiolitis obliterans, Asthma und chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung können die Antisense-Oligonukleotide gegen Präproendothelin-1 auch in Kombination mit anderen Arzneistoffen, wie Vasodilatatoren (z. B. Prostaglandinen, Prostaglandin-Analoga, Calciumkanalblocker, Adenosin oder Adenosin-Analoga) verwendet werden, um den Nutezn und die Zeitdauer, während welcher diese anderen Behandlungen verwendet werden können, zu maximieren.
Die Strategie, Antisense-Oligonukleotide gegen Präproendothelin-1 für die Behandlung von primärer pulmonaler Hypertonie und diesen anderen Krankheitszuständen zu verwenden ist eine wirksame Alternative zur herkömmlichen Arzneistoff-Gestaltung. Sie hat eine Reihe von Vorteilen. Die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden in Aerosolform sieht eine kontrollierte Verabreichung an die Lunge vor, wodurch die systemischen Wirkungen vermieden werden, welche Antagonisten auf die periphere kardiovaskuläre Funktion haben könnten. Außerdem ist durch das Abzielen auf die ET-1-Synthese mit Antisense-Oligonukleotiden die Identifizierung des (der) spezifischen Endothelin-Rezeptor-Subtyps(Subtypen), die an der Vermittlung der pathologischen Prozesse bei diesen Krankheitszuständen beteiligt ist (sind), kein Problem mehr. In ähnlicher Weise kann durch Vorsehen einer Behandlung, die die ET-1-Synthese inhibiert, die zugrunde liegende Vasokonstriktor-Antwort verhindert und die ET-1-abhängige Remodellierung des Gefäßsystems und der Luftwege vermieden werden, unabhängig davon, ob dieselben ET-1-Rezeptor-Subtypen beteiligt sind oder nicht. Bei der Behandlung von PH können auch Antisense-Oligonukleotide gegen Präproendothelin-1 in Kombination mit anderen Arzneistoffen, wie Bronchodilatatoren (z. B. beta-adrenergischen Agonisten, Methylxanthinen, Leukotrien-Antagonisten, Muscarin-cholinergischen Antagonisten, Glycocorticoiden) verwendet werden, um den Nutzen und die Zeitdauer, während welcher diese anderen Behandlungen benützt werden können, zu maximieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁, (UT-15) als Prostaglandin-Analog verwendet. Die Struktur von UT-15 ist nachstehend gezeigt:
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Zitierte Patentliteratur

- WO 99/11778 A [0005]
- WO 92/20823 [0039]
- US 5034506 [0039]

Claims

Antisense-Oligonukleotid, das zur humanen Präproendothelin-1-mRNA komplementär ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus WH11 und WH11A, welche Nukleinsäuresequenzen wie folgt:
oder ein Phosphorthioat-Derivat, ein Methylphosphonat-Derivat, ein Phosphoramidat-Derivat, ein Amid-Derivat oder ein Boranophosphat-Derivat davon aufweisen.
Pharmazeutisch wirksame Menge einer Zusammensetzung, die zumindest ein Antisense-Oligonukleotid nach Anspruch 1 aufweist, zur Verwendung bei der Reduktion der Endothelin-1-Synthese.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei das mindestens eine Antisense-Oligonukleotid zur Verabreichung in die Lungen bestimmt ist.
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Lungenkrankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bronchiolitis obliterans, Asthma und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei die das Antisense-Oligonukleotid umfassende Zusammensetzung weiters mindestens einen Arzneistoff aufweist, der die Vasokonstriktion inhibiert.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Arzneistoff ein Prostaglandin, ein Prostaglandin-Analog, ein Calcium-Kanalblocker, Adenosin oder ein Adenosin-Analog ist.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 5, wobei der Arzneistoff 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ oder ein Prodrug-Analog von 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-tri nor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ ist.
Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von pulmonaler Hypertonie.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von mindestens einem Antisense-Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus WH11 und WH11A, welche Nukleinsäuresequenzen wie folgt:
oder ein Phosphorthioat-Derivat, ein Methylphosphonat-Derivat, ein Phosphoramidat-Derivat, ein Amid-Derivat oder ein Boranophosphat-Derivat davon aufweist, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, der das mindestens eine Antisense-Oligonukleotid an die Lungen abgeben kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Aerosol oder einem Pulver.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, welche weiters mindestens ein Medikament umfasst, das die Vasokonstriktion inhibiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Arzneistoff Prostaglandin, ein Prostaglandin-Analog, ein Calcium-Kanalblocker, Adenosin oder ein Adenosin-Analog ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei der Arzneistoff 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ oder ein Prodrug-Analog von 9-Desoxy-2',9-alpha-methano-3-oxa-4,5,6-trinor-3,7-(1',3'-interphenylen)-13,14-dihydro-prostaglandin F₁ ist.