DE3690028C2

DE3690028C2 - Verfahren und Testkit für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper gegen Retroviren

Info

Publication number: DE3690028C2
Application number: DE3690028A
Authority: DE
Inventors: Robin Weiss; Richard Tedder; Cheingsong-Popov Rachanee; Bridget Ferns
Original assignee: Institute of Cancer Research
Current assignee: Institute of Cancer Research
Priority date: 1985-01-15
Filing date: 1986-01-13
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2006-01-14
Also published as: CH675636A5; IT8619072A0; GB8620371D0; SE8603803L; DE3690028T; ATA900186A; DK437386A; AU591647B2; FI863704A; HU204929B; GB2179449A; WO1986004423A1; BR8604533A; NL8620004A; SE8603803D0; HUT41129A; IT1191841B; FI863704A0; BE904030A; DK437386D0

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen Assay auf Antikörper für Retroviren, insbesondere jene, die mit dem erworbenen Immunmangelsyndrom (AIDS, von dem angelsächsischen Ausdruck acquired immune deficiency syndrome) assoziiert sind.

Die Wahrscheinlichkeit, daß das erworbene Immunmangelsyn drom (AIDS) durch ein infektiöses Mittel verursacht wird, ist seit einigen Jahren ersichtlich. Die Symptome dieser Krankheit wurden auf bestimmte, gut definierte Risikogruppen in einem Muster beschränkt, welches sehr wahrscheinlich macht, daß der Erreger durch Sexual- oder Blutkontakt über tragen wird. Obgleich diese Krankheit anfangs in den Ver reinigten Staaten von Amerika entdeckt wurde, tritt ein erhöhtes Vorkommen der Krankheit auch sonst, einschließlich in Europa, auf.

Eine Methode, von der man annimmt, daß durch sie die Krank heit übertragen wird, ist die Transfusion von Blut, wel ches von Spendern gespendet wurde, welche selbst mit Aids virus infiziert sind. Das Sammeln von gespendetem Blut bedeutet, daß, wenn Blut, welches von einem Spender gespen det wird, der ein Aidsvirus beherbergt, mit Proben von Blut von anderen Spendern vereinigt wird, dann das gesamte Blut und die anderen Produkte, die von diesem Pool stammen, kontaminiert sind, unabhängig davon, wie klein oder groß die Probe ist. Viele der Blutspender, welche ein Aids virus beherbergen, sind sich ihrer Infektion, insbesondere in den Anfangsphasen der Infektion, nicht bewußt und ande re infizierte Spender werden sich, selbst wenn sie von ihrer Infektion wissen, weigern, entweder zuzugeben, daß sie die Krankheit haben oder daß sie zu einer Gruppe mit hohem Risiko gehören.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, relativ einfache, aber vollständig zuverlässige Tests, gemäß denen Proben aus Blut, welches für Transfusionszwecke bestimmt ist, auf die Anwesenheit von Aidsvirus oder Antikörpern für Aidsvirus routinemäßig getestet werden können, bereitzustellen.

Ferner bestand ein Bedarf nach einem Isolat (Virus), das in einem derartigen Assay verwendet werden kann, d. h. einem Isolat, das für längere Zeitspannen aufrechterhalten werden kann und in einer Wirtszellinie gezüchtet werden kann.

Blutspenden, die in dem Test positiv reagieren, können für Transfusions zwecke zurückgewiesen werden, und die Kontamination ande rer Blutproben durch das Zusammengeben mit der kontaminier ten Probe kann vermieden werden.

Die Forschung hinsichtlich der Identifizierung und Isolie rung des Erregers, welcher für Aids verantwortlich ist, wird seit etwa 2 Jahren aktiv betrieben. Es gibt aber zwi schen den verschiedenen Forschern auf diesem Gebiet hin sichtlich der genauen Identität und Nomenklatur keine Übereinstimmung. Über einen sogenannten Aidsvirusextrakt (Isolat) wurde zuerst 1983 von Montagnier und seinen Kolle gen in Frankreich berichtet, die das Material "Lymphadeno pathy Associated Virus One" (LAV-1) bezeichneten. Ungefähr ein Jahr später haben Gallo und seine Kollegen in den Ver einigten Staaten Einzelheiten hinsichtlich der Isolierung eines anderen sogenannten Aidsvirus publiziert, welchen sie dann als "Human T-lymphotropic Virus Type III" (HTLV- III) bezeichneten.

Die GB 2 016 687 beschreibt ein stabiles Reagens, das zur Durchführung von Immunoassays nützlich ist, welches ein zuckerbeschichtetes Immunoadsorbens in Bindung an einen festen Träger umfaßt. Das Immunoadsorbens kann in einigen Fällen eine Vorbeschichtung mit einem Antikörper umfassen. HTLV-Assays unter Verwendung von HTLV-Antigenen, die direkt auf die Kavitäten einer Mikrotiterplatte absorbiert sind, sind in der EP-A 136 798 beschrieben. Die US-4 520 113 beschreibt den Nachweis von Antikörpern in Seren von Aids und prä-Aids-Patienten und beschreibt die biochemische und immunologische Analyse von Antigenen, die mit dem mensch lichen MTLV-III-T-Zell-Leukämievirus assoziiert sind. In Science 225 (1984) 321-323 werden Antikörper gegen das Core- Protein des Lymphadenopathie-assoziierten Virus (LAV) bei Aids-Patienten beschrieben.

Die Anmelderin war jetzt in der Lage, aus einem Lymphknoten tumor ein humanes T-lymphotropes Retrovirus, welches mit HTLV-III und LAV verwandt ist, zu isolieren und welches von der Anmelderin als CBL-1 bezeichnet wurde. Das CBL-1-Mate rial der Anmelderin ist ein stabiler Extrakt, welcher in einer Wirtszellinie gezüchtet werden kann und in einem Assay für den Nachweis von Antikörpern gegen das Aidsvirus in Serumproben verwendet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper gegen Retroviren, bei dem man die biologische Probe

(1) mit einem Immunglobulin, welches einen spezifi schen Antikörper für die Retrovirus-Antigene enthält, und welches mit einem Erkennungsmarker markiert ist, mischt,
(2) mit einem insolubilisierten Antigen, welches An tigene von humanen Retroviren, die mit den nachzuweisenden Retroviren ätiologisch verwandt sind, gebunden an Globulin oder an monoklonale Antikörper, enthält, wobei das Globulin oder der Antikörper selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, in Kontakt bringt, und bei dem man
(3) die flüssige Phase von der festen Phase abtrennt und die Menge an Erkennungsmarker, die entweder mit der flüssigen oder der festen Phase assoziiert ist, bestimmt.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von Antigenen des humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1, der ätiologisch zu Aids verwandt ist, zum Nachweis von Antikörpern gegen Retro virus.

Es wurde gefunden, daß CBL-1 während langer Zeiten in einer leukämischen T-Zellinie, die als CCRF-CEM bezeichnet wird und von Foley et al, Cancer 18, 522-529 (1965) beschrieben wird, gehalten werden kann, und die Erfindung betrifft wei terhin CCRF-CEM-Zellen, welche das erfindungsgemäße CBL-1- Virus beherbergen.

Für Bestätigungszwecke hat die Anmelderin Proben der CCRF-CEM-Zellen, welche den anmeldungsgemäßen CBL-1-Virus beherbergen, bei der National (jetzt European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) bei dem Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Re search, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG England hinterlegt. Die Hinterlegungsstelle NCACC wurde als Inter nationale Hinterlegungsstelle gemäß dem Budapester Vertrag von 1977 anerkannt. Die Hinterlegung erfolgte am 11. Januar 1985 und erhielt die Hinterlegungsnummer 85 01 1101.

Das anmeldungsgemäße CBL-1-Material wurde aus Lymphozyten isoliert, die in einer Biopsie eines Lymphknotentumors eines britischen Patienten gezüchtet wurden, der auf Immuno blasten-Lymphom, das mit Aids assoziiert war, behan delt wurde. Fragmente der Biopsie wurden in einem Kultur medium gehalten, zu dem man einen T-Zellenwachstumsfaktor zugab, und nach etwa 2 Tagen wurden die CCRF-CEM-Zellen zu der Kultur gegeben, welche bei solchen Bedingungen gehalten wurde, daß die primären Lymphozyten im Verlauf von etwa einem Monat verschwanden, während die CCRF-CEM-Zellen sich vermehrten und chronisch mit dem CBL-1-Virus infiziert wur den.

Es wurde gezeigt, daß das CBL-1-Virus den zuvor beschriebe nen Extrakten von HTLV-III verwandt ist, da es

(a) die Aktivität der reversen Transkriptase mit einer Bevorzugung von Mg⁺⁺-Kationen besitzt, und außerdem
(b) die Morphologie der Viruspartikel, welche durch Elektronenmikroskopie kenntlich gemacht wurde, besitzt
(c) durch indirekte Immunofluoreszenz, die für Virenanti gene in CBL-1 infizierten CCRF-CEM-Zellen mit Seren, her gestellt von Aids-Patienten, spezifisch ist,
(d) durch Vergleich in dem Festphasen-Radioimmuno assay mit HTLV-III und LAV-1,

und somit von der taxonomischen Gruppe der Retro viridae umfaßt wird, welche humane T-zellenlymphotrope Viren enthalten.

Eine vorläufige DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß die Sequenz des CBL-1-Virus, obgleich sie eng mit der der anderen humanen T-lymphotropen Retroviren, die bis jetzt be schrieben wurden, verwandt ist, nicht mit der der zuvor be schriebenen Materialien identisch ist, sondern an verschie denen Stellen eine Sequenzvariation zeigt.

Es wurde gezeigt, daß die infizierten Zellen, die beim ECACC hinterlegt wurden, kontinuierlich Viren und virale Antigene im Verlauf von mindestens 6 Monaten synthetisie ren.

Obgleich gefunden wurde, daß CCRF-CEM-Zellen ein idealer Wirt für das anmeldungsgemäße CBL-1-Virus ist, wurde ge funden, daß die Zellen ebenfalls verwendet werden können, um ein ähnliches Virus zu beherbergen, welches von der Anmelderin aus dem peripheren Blut des gleichen Patienten, dem die Lymphknotentumorbiopsie entnommen wurde, isoliert wurde und ähnliche Viren, die von anderen Patienten, die mit Aids verwandten Viren infiziert sind, isoliert wurden. Die An melderin hat gezeigt, daß diese Zellinie einen wertvollen Wirt für die in-vitro-Züchtung nicht nur von dem anmeldungs gemäßen CBL-1-Material, sondern ebenfalls von anderen ver wandten Materialien ergibt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Testkit, das

(1) eine erste Komponente, welche ein insolubilisier tes Antigen ist, welches Antigene von humanen Retroviren, die mit den nachzuweisenden Retroviren ätiologisch verwandt sind, gebunden an Globulin oder an monoklonale Antikörper, enthält, wobei das Globulin oder der Antikörper selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und
(2) eine zweite Komponente, welche ein Immunglobulin ist, das einen spezifischen Antikörper für die Retrovirus- Antigene enthält, und welches mit einem Erkennungsmarker markiert ist,

umfaßt.

Wie oben angegeben, ist die Hauptverwendung von CBL-1 die, daß es eine Komponente in einem Testsystem für die Routine prüfung von Transfusionsblut ist, um festzustellen, ob es von einem Subjekt, welches mit Aidsvirus infiziert ist, stammt. Die Anmelderin hat ein System auf der Grundlage des gleich zeitigen Konkurrenzassays unter Verwendung von immobilisier ten CBL-1-Antigenen oder anderen Retrovirus-Antigenen als feste Phase und des Testserums als flüssige Phase entwickelt.

Genauer gesagt, basiert der anmeldungsgemäße gleichzeitige Konkurrenzassay auf der Immobilisierung des CBL-1-Antigens oder eines anderen Retrovirus-Antigens durch seine Bindung an eine feste Phase über einen Liganden, beispielsweise Globu lin oder einen anderen Antikörper, und dann erlaubt man, daß die Bindungsstellen an diesem immobilisierten Antigen für die konkurrierende Einwirkung eines Gemisches aus Testserum-Antikörper und bekanntem Antikörper für das Aids virus, welcher durch das Erkennungsmittel identifiziert werden kann, zur Verfügung stehen. Die Anmelderin hat ge funden, daß die zufriedenstellendsten Ergebnisse erreicht werden können, wenn das Erkennungsmittel ein Enzymmarker ist. Die Verwendung eines Enzymmarkers anstatt einer radioaktiven Markierung besitzt Vorteile, da die Bestrahlungsbio gefahr nicht auftritt, und eine unerwartete Konsequenz ist, daß die Assay-Immuninkubation auf 1 Stunde oder darunter verkürzt werden kann.

Eine weitere Alternative ist die Verwendung der Immun fluoreszenz zur Kenntlichmachung der Anwesenheit eines be kannten Antikörpers, der an ein immobilisiertes Antigen ge bunden ist.

Wie oben angegeben, wurde gefunden, daß die besten Ergeb nisse erhalten werden, wenn das Antigen an die feste Phase über einen Liganden, der ein Antikörper ist, gebunden ist. Eine Technik ist die Verwendung eines Humanserums mit hohem Titer, welches von irgendeinem, der asymptomatisch mit Aids viren infiziert ist, entnommen wurde. Das ideale Serum wird einen hohen Titer an Antikörpern für Aidsviren enthalten, wird jedoch von einem Patienten stammen, dessen Immunglo bulinwerte im Normalbereich liegen. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der ge genüber dem Retrovirus gezüchtet wurde. Wird dieser in an sich bekannter Weise unter Verwendung von Mäusen gezüchtet, dann können bestimmte Vorteile sichergestellt werden, wie es im folgenden genauer erläutert wird.

Das Material für die feste Phase ist zweckdienlich Poly styrol, welches in Form von Rohren, Perlen oder bevorzugt als Plättchen mit einer Vielzahl von Oberflächenwellen oder anderen Oberflächeneindrücken bzw. -vertiefungen verwendet wird. Gamma-Globulin, das aus dem ausgewählten Serum oder einem anderen Antikörper hergestellt worden ist, wird dann auf das Polystyrol aufgetragen, und das Antigen wird an das mit Globulin beschichtete Polystyrol unter Bildung der ersten Komponente des Tests gebunden. Diese Komponente kann naß oder trocken während mehrerer Monate gelagert werden.

Die zweite Komponente des Tests umfaßt die IgG-Fraktion, die aus dem Testserum isoliert worden ist, und wenn die Er kennung mittels einer Enzymmarkierung erfolgt, kann diese IgG-Fraktion beispielsweise mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) nach an sich bekannten Verfahren konjugiert werden.

Das erfindungsgemäße Testkit kann zum Vermischen der mar kierten IgG-Komponente mit dem Testserum und Inkontaktbrin gen des Gemisches aus IgG und Testserum mit dem insolubi lisierten Antigen, Trennen der festen und flüssigen Phasen voneinander und Bestimmung des Ausmaßes, gemäß dem das IgG an das Antigen gebunden wurde, verwendet werden. Entspre chend den gleichzeitigen Konkurrenz-Assays ist, je größer das Ausmaß ist, gemäß dem die IgG-Komponente der flüssigen Phase an die feste Phase gebunden ist, um so geringer die Menge an Antikörper oder Antigen in dem Testserum. Durch Auswahl geeigneter Kontrollwerte ist es daher möglich, einen Routinetest zu haben, wo, wenn HRPO als Markierungsmittel verwendet wird, das Testserum als frei von Aids-Antikörper oder Antigen angesehen werden kann, vorausgesetzt, daß die optische Dichte (OD) der Testprobe einen vorbestimmten Minimalwert erreicht. Irgendeine Probe des Testserums, wel che eine OD-Zählung unter dem vorbestimmten Wert, der auf gezeichnet wurde, verursacht, kann daher zurückgewiesen werden, wodurch eine Transfusion mit einer Blutspende, die möglicherweise mit Aidsvirus oder Antikörper kontaminiert ist, vermieden wird.

Als Alternative zu CBL-1 als Retrovirus-Antigen in dem Assayverfahren und dem diagnostischen Testkit gemäß der vor liegenden Erfindung kann man andere Retroviren verwenden. Diese können andere humane Retroviren sein, die ätiologisch mit dem Aidsvirus, wie dem humanen T-lymphotropen Retro virus HTLV-III oder anderen humanen Retroviren, wie dem humanen T-Leukämievirus, HTLV-II oder HTLV-I oder tieri schen Retroviren, wie dem Maedi-Visna oder Rinder-Leukosis virus verwandt sind.

Wie es im folgenden näher erläutert wird, ergibt die indi rekte Bindung von humanen Retrovirus-Antigenen an die feste Phase über das Globulin eine bestimmte Vervielfältigung der Ergebnisse, und das Testformat erlaubt eine einfache, schnel le und genaue Bestimmung auf die Anwesenheit oder Abwesen heit der Kontamination von Blutproben durch relativ wenig ausgebildete und ungeübte Techniker.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Elektronenmikrographie mit 81000facher Vergrößerung, wo CBL-1-Teilchen aufkeimen, und lokalisiert an der Grenze der CCR-CEM-Wirtszellen dargestellt sind.

Fig. 2 zeigt den Festphasen-ELISA für Anti-HTLV-III. In der Figur sind die optischen Dichten, die man bei einer Reihe von Tests klinischer Seren einschließlich solcher, die für Anti-HTLV-III reaktiv und nichtreaktiv sind, sowie Ergebnisse, die zuvor durch Radioimmunoassay bekannt waren, dargestellt.

In Fig. 3 sind ähnliche Ergebnisse wie in Fig. 2 darge stellt, jedoch diesmal für Anti-HTLV-I, bestimmt gemäß einer ähnlichen, einstufigen, gleichzeitig konkurrierenden ELISA.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung und Charakterisierung von CBL-1

Der Virus CBL-1 wurde aus Lymphozyten isoliert, die aus einer Lymphknotentumorbiopsie eines britischen Patienten, der auf Immunoblasten-Lymphom behandelt wurde, welcher mit dem erworbenen Immunmangelsyndrom (AIDS) assoziiert ist, kul tiviert. Die Lymphknotenbiopsie wurde in kleine Fragmente geschnitten und in ein Kulturmedium gegeben, welches aus RPMI-1640 Grundmedium, ergänzt mit 10%igem fötalem Kalb serum und 10 µg/ml Phytohaemagglutinin, bestand. Nach 24 Stun den wurde konditioniertes Medium, welches T-Zellenwachstums faktor, geerntet von gemischten Kulturen aus tonsillaren Lymphozyten, enthielt, zugegeben, und das Phytohaemaggluti nin wurde entfernt. 48 Stunden nach der Initiierung der Kultur wurde Antiserum für Interferon alpha zugegeben. Nach 48 Stunden wurden CCRF-CEM-Zellen (im folgenden als CEM-Zel len bezeichnet) ebenfalls zugegeben. Die CEM-Zellen sind eine permanent wachsende leukämische T-Zellenlinie, die von Foley et al (1965) Cancer 18 : 522-9 beschrieben wird.

Unter den Züchtungsbedingungen verschwinden die primären Lymphozyten im Verlauf von 4-wöchiger Kultur, während die CEM-Zellen exponentiell wuchern. Der CBL-1-Virus, produziert durch die primären Lymphozyten, infiziert die CEM-Zellen, und nach 8-wöchiger Kultur sind die CEM-Zellen chronisch mit dem CBL-1-Virus infiziert. Die Erhaltung der CBL-1-in fizierten CEM-Zellen erforderte keinen T-Zellenwachstums faktor oder Anti-Interferon alpha. Diese CBL-1-infizierten CEM-Zellen wurden wie oben angegeben bei NCACC unter der Hinterlegungsnummer 85 01 1101 hinterlegt.

Es konnte gezeigt werden, daß der CBL-1-Virus den zuvor be schriebenen Isolaten von HTLV-III/LAV verwandt ist, da es (a) die Aktivität einer reversen Transkriptase mit einer Bevorzugung von Mg²⁺-Kationen aufweist, und durch die Morphologie der Virus teilchen, die durch Elektromikroskopie (vgl. Fig. 1) sicht bar gemacht wurden, und (b) durch indirekte Immunofluores zenz, die für die viralen Antigene in CBL-1-infizierten CEM-Zellen mit Seren, hergestellt von Aids-Patienten, spe zifisch ist, und durch Vergleich mit anderen Aidsvirusextrak ten in dem Festphasen-RIA. Die CEM/CBL-1-Zellen haben den Virus und virale Antigene im Verlauf von 6 Monaten kontinuier lich weitersynthetisiert.

Beispiel 2 1. Antigen-Herstellung

Ein rohes, gefroren und aufgetautes Zell-Lysat wird auf folgende Wei se hergestellt. HT-H9-Zellen, infiziert mit HTLV-IIIB, kön nen zu einer maximalen Dichte in einer Suspensionskultur wachsen. Die Kulturen werden auf 4°C gekühlt, und 0,25% v/v β-Propiolacton werden während 2 Stunden zugegeben. Die Zellen werden dann aus der Kulturflüssigkeit abzentrifugiert und mit niedriger Geschwindigkeit pelletiert. Die Zellpel lets werden erneut in destilliertem Wasser resuspendiert und drei Gefrier/Tauzyklen unterworfen. Bei jedem Zyklus wird der Rest der Zellpellets sorgfältig resuspendiert. Nach dem dritten Zyklus wird der Extrakt auf 0,25% vol/vol mit β-Propiolacton eingestellt und bei 4°C während 2 Stun den gehalten. Er wird dann auf 37°C während einer halben Stunde erwärmt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert im Be reich von 7,4 gehalten. Das rohe Lysat wird geklärt und bei -20°C gelagert. Vor der Verwendung wird es in TRIS-Puffer, ergänzt mit 0,1% BSA und Detergens, verdünnt. Die Wahl des Detergens und seine Konzentration ist wichtig, und es wur de gefunden, daß die Verwendung von Tween 20 bei einer Kon zentration von 0,1% optimal ist, wodurch die Aktivität der Antigenpräparation dreifach oder manchmal mehr verstärkt wird. Nach Verdünnung in TRIS-BSA/Tween 20 wird das Anti gen 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Es ist während dieser Stufe, daß eine Antigenverstärkung auftritt.

Die Antigen-Präparation, die auf diese Weise erhalten wur de, kann verwendet werden, um die Expression von HTLV-III- Antigen bei verschiedenen definierten Kulturbedingungen zu verfolgen. Die Antigenizität kann in Festphasen-RIA unter Verwendung von Festphasen-Anti-HTLV-III und einem zweiten Reagens, welches ¹²⁵-J Anti-HTLV-III enthält, quantitativ eingeteilt werden. Bei der letzten Analyse wird das Anti gen in einer Verdünnung verwendet, welche ein P-N-Verhält nis von 10 : 1 mit 1 bis 2% Markierungsbindung in Anwesen heit negativer Sera (vgl. im folgenden unter Assayverfahren) erlaubt. Es gab eine variable Abstoßung der viralen Anti gene in das überstehende Fluid der Zellen, aber in relati ven Beziehungen wurde die Hauptmasse des nachweisbaren Antigens in den Zellpellets gelassen. Dies galt für CBL-1 und für andere Isolate (Extrakte) von HTLV-III, die in CEM-Zellen oder HT-H9-Zellen vorhanden waren. Es gab keine Beschränkung der Antigenreinheit (vgl. im folgenden), und es war richtig, die Antigenexpression in den Zellen zu maximieren. Die Antigen-Präparation, die hier verwendet wurde, war leicht herzustellen, vermutlich mit höherer Aus beute pro Volumen Zellkultur als Antigen, welches aus Über standsflüssigkeit hergestellt wurde, und sie ist bei -20°C stabil. Sie kann leicht durch β-Propiolacton inaktiviert werden. Man kann ebenfalls stark erwarten, daß durch die Verwen dung von Tween 20 der Titer von irgendeinem infektiösen Virus verringert wird.

2. Antisera

Das Reagens für den Assay wird aus menschlichem Serum mit hohem Titer hergestellt, welches aus Personen stammt, die asymptomatisch mit dem Aids-Retrovirus infiziert sind. Die Aus wahl der Sera für die Reagensherstellung war wichtig. Das Serum hatte einen hohen Titer von Anti-HTLV-III gemäß RIA und kam von einem Patienten, dessen Immunglobulingehalte im Normalbereich lagen. In der Praxis ist es im allgemeinen erforderlich, Reagenzien von einer kleinen Zahl Seren her zustellen, die die obigen Kriterien erfüllen, und das Wirken der Reagenzien in dem Assay zu prüfen. Damit diese Reagen zien nichtinfektiös sind, werden die als Ausgangsmaterial verwendeten Sera durch Erhitzen bei 56°C während 30 Minuten behandelt.

(a) Herstellung von Anti-HTLV-IIIB-Globulin

Dieses Material wird zur in-situ-Reinigung an einem Fest phasen-HTLV-IIIB-Antigen verwendet. In dieser Strategie lie gen beachtliche Vorteile. Globulin von wärmebehandeltem Serum wird zweimal mit 40% gesättigtem Ammoniumsulfat prä zipitiert. Dies ist das einfachste Reagens für die Globu linbeschichtung, durch die es möglich ist, entweder Gesamt serum oder gereinigtes IgG zu verwenden. Das Globulin wurde mit einer optimalen Verdünnung verwendet, welche durch individuelle Titration des Reagenzes bestimmt werden muß. Das Festphasenmaterial war Polystyrol in Form von Kavitäten und wurde mit Globulin beschichtet. Die freien Bindungsstellen wurden dann mit einem inerten Protein - in diesem Fall 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) - abgesättigt. Die beschichtete und abge sättigte feste Phase wurde naß bei 4°C während Monaten gelagert. Ein Trocknen ergab ein noch stabileres Produkt. Zum Beschichten der festen Phase wurde HT-H9/HTLV-IIIB- Lysat, wie oben beschrieben, in TRIS-BSA-Tween-Puffer bis zu einer Verdünnung, welche, in nachfolgenden Tests, die Möglichkeit ergab, daß 1 bis 2% der Markierung an negatives Serum gebunden wurde, verdünnt. Die Beschichtung wurde am wirksamsten während einer 2tägigen Inkubation des Antigens bei Raumtemperatur in fester Phase und anschließender Naß lagerung bei 4°C bis zur Verwendung erreicht. Vorversuche zeigten, daß die feste Phase in dieser Form während mehre rer Monate stabil ist. Sie kann jedoch ebenfalls ohne signi fikanten Verlust der Potenz getrocknet werden und verbleibt während mehrerer Monate stabil.

(b) Markierung von Globulin

Das in 2(a) oben beschriebene IgG wird mit HRPO unter Ver wendung von heterobifunktionellen Derivaten in üblicher Weise konjugiert, wobei man ein molares Substitutionsver hältnis von 1 : 3 erhält. Dieses Material wurde in Assoziation mit der oben in 2(a) beschriebenen festen Phase in einem Enzymimmunoassay für den Nachweis von Antikörper für Aids- Retroviren in Proben von Körperflüssigkeiten verwendet.

Für Vergleichszwecke wurde eine weitere Probe des IgG mit ¹²⁵-J bis zu einer spezifischen Aktivität von 15 µCi pro µg Protein markiert.

Beispiel 3 Einstufige Konkurrenz-ELISA für Anti-CEM/CBL-1-Serumrea genzien

Ein humanes Serum, welches einen hohen Titer an Anti-HTLV- III enthielt, wurde für die Herstellung von beschichtetem Globulin, wie zuvor in Beispiel 2.2 beschrieben, verwendet. Polystyrol-Kavitäten mit rundem Boden werden mit einer opti malen Verdünnung von Globulin beschichtet und dann mit einem inerten Protein, in diesem Fall 0,1% BSA, abgesättigt.

Das gleiche Serum wird als Quelle für Immunglobulin verwendet, welches durch Ionenaustausch chromatographie an DE 52, wie zuvor beschrieben, gereinigt wurde. IgG wurde mit Meerrettich-Peroxidase bei einem unge fähren Substitutionsverhältnis von 3 Molekülen Meerrettich- Peroxidase pro 1 Molekül IgG gekuppelt.

Die Wirkung des Konjugats wird durch Inkubation über Kavi täten, die zuvor mit einem indirekten Antikörper mit Virus- Antigenen, welche von HTLV-III infizierten Zellen stammen, und mit Antigenen nichtinfizierten Zellen beschichtet waren, bestimmt. Die optimale Verdünnung des Konjugats wurde als die genom men, bei der man eine maximale Farbbindung mit dem infizier ten Zell-Antigen und eine minimale Farbbindung mit den nicht infizierten Zellen erhält.

CEM/CBL-1-Antigen

Zellen, welche dauernd mit CEM/CBL-1-Virus infiziert sind, wurden bis zur maximalen Dichte in nichthaftenden Rührkul turen gezüchtet. Die Rührkulturen werden auf 4°C abgekühlt und dann auf 0,25% Volumen mit β-Propiolacton gebracht. Nach 2stündiger Inkubation bei 4°C werden die Zellpellets geerntet und den Gefrier- und Auftauzyklen unterworfen und dann, wie zuvor beschrieben, durch Zentrifugieren geklärt. Der Gewebekulturextrakt wird dann mittels weiterer 2 Stun den Inkubation bei 4°C mit 0,25% β-Propiolacton behandelt und dann wie zuvor hydrolysiert. In diesem Fall ist das Verdünnungsmittel für die Zellaufbrechung und den Gefrier- Auftauzyklus phosphatgepuffertes Salz, welches mit 0,1% Tween 20 ergänzt ist. Die Antigen-Präparationen werden an schließend an einer festen Phase titriert, welche mit hohem Titer Anti-HTLV-III-Globulin beschichtet ist. Die Verdünnung, welche einen OD 450 nm zwischen 1,0 und 1,2 bei den im fol genden definierten Bedingungen ergab, wurde als Arbeitsver dünnung für den darauffolgenden Test verwendet.

Optimierung und Format bzw. Größe der Tests

Kavitäten, die mit Globulin mit hohem Titer beschichtet sind und anschließend abgebunden bzw. abgeschreckt wurden, wer den mit 100 µl einer optimalen Verdünnung von CEM/CBL-1-An tigen inkubiert. Nach einer über-Nacht-Inkubation bei Raum temperatur werden die Antigenextrakte von den Schälchen ab gewaschen, welche dann bei solchen Bedingungen getrocknet wurden, von denen gefunden wurde, daß sie die Stabilität immobilisierter CEM/CBL-1-Virusantigene aktivieren. Zum Testen werden 25 µl antikörperpositives- und antikörpernega tives Serum in getrennte Schälchen gegeben und 75 µl ELISA- Konjugat in detergensergänztem destilliertem Wasser werden zu den Kavitäten gegeben. Das Gemisch aus Testserum und Kon jugat wird in den Schälchen während unterschiedlicher Zei ten bei unterschiedlichen Bedingungen (Immuninkubation) inkubiert. Die Kavitäten werden dann dreimal mit Salzlösung- Tween (0,8% Natriumchloridlösung, ergänzt mit 0,1% Tween 20) gewaschen. Nach drei Waschvorgängen werden die Kavitäten mit Salz-Tween gefüllt und können während 2 Minuten bei Raumtemperatur die Feuchtigkeit aufnehmen. Danach wird der Waschvorgang mit drei Waschzyklen wiederholt. Danach wer den 100 µl Chromogensubstrat, in diesem Fall 3,3′,5,5′- Tetramethylbenzidin (TMB) zugegeben. Nach 20minütiger Inku bation bei Raumtemperatur wird die Chromogenfreigabe durch Zugabe von 50 µl von 4 normaler Schwefelsäure beendigt. Die Farbstofffreigabe wurde spektrophotometrisch bei 450 nm ge messen. Die Arbeitsverdünnung von irgendeinem besonderen CEM/CBL-1-Antigen wird als die Verdünnung angenommen, bei der man zuverlässig eine optische Dichte zwischen 1 und 1,2 mit negativem Serum erhält, wenn es bei ELISA unter opti malen Bedingungen, definiert als Immuninkubation von 1 Stunde bei 45°C, verwendet wurde.

Ergebnisse

Beim Vergleich zwischen den Ergebnissen, die man bei dem an sich bekannten RIA unter Verwendung einer festen Phase und ¹²⁵-J-markiertem IgG, beschrieben wie in Beispiel 2, erhält und den ELISA-Ergebnissen, die man bei diesem Beispiel er hält, werden zwei unerwartete Vorteile erkennbar, die zu Gunsten von ELISA sprechen. Erstens erhält man bei subopti malen Antigen-Präparationen, welche in RIA schlechte Ergeb nisse geben, beim gleichen Titer gute Ergebnisse bei ELISA. Zweitens ist es, wie in der Tabelle erläutert wird, mit RIA nicht möglich, die Inkubationszeiten unter 3 Stunden zu verringern. Es besteht aber ein Bedarf für einen schnellen Assay, d. h. 1 bis 2 Stunden insgesamt, bei der Transfusions durchführung, und dies ist nur mit ELISA möglich.

TABELLE

Zeit/Temperaturversuche in RIA mit ¹²⁵-J-markiertem IgG

In der Fig. 2 sind die Ergebnisse des Tests mit ELISA für 56 klinische Seren dargestellt, die in diesem Fall von haemophilen Patienten stammen, und mit im Handel erhält lichen und nichterhältlichen Faktor-VIII-Konzentration behandelt wur den und von Homosexuellen stammen. Aus der Figur ist klar erkennbar, daß eine klare Trennung zwischen Seren, die für Anti-CEM/ CBL-1 reaktiv sind,und nichtreaktiven Seren vorhanden ist.

In diesem besonderen Beispiel ist die mittlere optische Dichte von 16 Seren, die reaktiv für CEM/CBL-1-Antikörper sind, 0,085 (0,037 bis 0,327), und die mittlere optische Dichte für 40 Seren, die für diesen Antikörper nicht reak tiv sind, beträgt 1,16 (0,738 bis 1,352). Das Serum a stammt von einem kranken Aids-Patienten im Endstadium und ist schwach reaktiv bei IF und den direkten Bindungsassays. Die Seren b und c sind beim erneuten Testen nicht reaktiv.

Es wurde genau das gleiche Schema in einem Überblick der Bluttransfusionsseren in Großbritannien verwendet. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurden über 12 000 Seren von Spendern geprüft. 3 Seren ergaben Screen-Testreaktionen, jedoch fand man beim erneuten Testen, daß nur ein einziger Spender reaktiv war. Das Serum war wiederholt reaktiv, war titrier bar und demonstrierte eine starke Reaktivität bei der Immunofluoreszenz gegenüber infizierten, aber nicht gegen über nichtinfizierten Zellen. Die Random-Reaktivität von Seren, welche in keiner Beziehung zu CEM/CBL-1-Infektionen standen, war dementsprechend extrem niedrig. Darauffolgen de Versuche für die Titration von Seren, welche reaktiv für Anti-HTLV III waren, zeigten, daß die Titer weitgehend die gleichen sind, wenn sie sowohl gemäß dem CEM/CBL-1-ELISA als auch gemäß den direkten Assays geprüft werden. Dies wurde durch die darauffolgende Prüfung der Seren, die von Patienten entnommen wurden, welche eine akute Seroconver sion nach der primären HTLV-III-Infektion hatten, bestätigt. Wieder war hier grob kein Unterschied im Gehalt oder zum Zeitpunkt der Anfangsreaktivität sowohl bei dem direkten Bindungsassay als auch bei dem Konkurrenz-ELISA. Unter Verwen dung des gleichen Assays waren Seren von Patienten mit oligo- und panreaktiven Anti-Lymphozyt-Antikörpern und Seren von Patienten mit Autoimmunkrankheiten bei dem glei chen Konkurrenz-ELISA nicht aktiv. Zusammengefaßt zeigen diese Werte an, daß die Spezifizität und Empfindlichkeit dieses Konkurrenz-ELISAs für Antikörper für den Aids ver wandten Retrovirus hoch sind.

Beispiel 4 Einstufige Konkurrenz-ELISA für Anti-HTLV-I

Seren und Reagenzien werden auf gleiche Weise, wie bei dem CEM/CBL-1-Immunoassay von Beispiel 3, ausgewählt und her gestellt, mit der Ausnahme, daß Zellen, die mit HTLV-I in fiziert sind, für die Antigen-Präparation, und Seren von Patienten, die mit HTLV-I infiziert sind, als Quelle für die Reagenzien verwendet werden. In der Fig. 3 ist die optische Dichte dargestellt, die man bei 32 klinischen Seren einschließlich drei bekannter schwach positiver Kon trollen erhält. Es tritt ein klarer Unterschied zwischen reaktiven und nichtreaktiven Seren auf, wobei die mittlere optische Dichte von 5 reaktiven Seren für diesen Antikörper 0,099 (0,060 bis 0,129) und die mittlere optische Dichte für 24 Seren, die nicht für diesen Antikörper reaktiv sind, 1,64 (1,48 bis 1,83) betragen. Der Test war beständig und die Bedingungen können in der Praxis variiert werden. Es wur de jedoch entschieden, daß man eine Immunoinkubation von 1 Stunde bei 45°C als optimal ansieht. Dies ist parallel zu den Bedingungen für den Nachweis von CEM/CBL-1-Antikör per.

Der Test wurde im gleichen Schema verwendet, um über 1000 nichtausgewählte britische Blutspender zu untersuchen, und es wurden keine reaktiven Seren identifiziert. Im Gegen satz dazu gab eine selektive Prüfung von etwa 75 Spendern aus Afrika und der Karibik einen einzigen Donor, der zum ersten Mal seropositiv war.

Das obige Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von Seren von Patienten, die mit HTLV-II infiziert waren, als Quelle für die Beschichtung mit Globulin und als Quelle für IgG. Die mit HTLV-II infizierten Zellen wurden als Antigenquelle verwendet. Diese Reagenzien werden auf gleiche Weise, wie zuvor im Beispiel 2 für Anti-HTLV-III- RIA beschrieben, ausgewählt und hergestellt.

Beispiel 5 Herstellung und Verwendung eines Testkits 1. Reagenzien

Eine Polystyrolplatte mit vielen Kavitäten (eine Multi wellplatte), welche 96 Kavitäten enthielt, wurde min destens auf der Innenoberfläche der Kavitäten mit ge reinigtem, in der Wärme behandeltem Antikörper für CBL-1 beschichtet. Der Antikörper stammt aus einem wärme behandelten Serum eines Menschen, welcher mit dem Aids-Retro virus infiziert war. Nach dem Beschichten des Polystyrols mit dem Antikörper werden die freien Bindungsstellen mit einem inerten Protein abgesättigt, in diesem Fall mit Rinderserumalbumin. Das für die Insolubilisie rung auf den Polystyrolplatten verwendete Antigen war CBL-1. Diese wurde zuerst mit dem viriciden β-Propiolacton behandelt, und dann wurde eine Suspension von inaktivier tem CBL-1 in TRIS-BSA-Tween-Puffer mit dem behandelten Polystyrol während etwa 2 Tagen bei Raumtemperatur inku biert. Auf diese Weise wurde das CBL-1 durch indirekte Bindung an den Polystyrolträger über den Antikörper in solubilisiert. Diese Komponente ist die erste Komponente des Testkits.

Die zweite Komponente des Testkits wird hergestellt, in dem man den gleichen humanen Antikörper, welcher zur Be schichtung des Polystyrols, wie oben beschrieben, ver wendet wurde, markierte. Der Antikörper wurde durch Kon jugation mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) unter Verwendung an sich bekannter Konjugationsverfahren markiert. Der mit HRPO markierte Antikörper wird in einem gefriergetrockne ten Zustand gelagert und unmittelbar vor der Verwendung mit einer Suspension in einem wäßrigen Verdünnungsmittel rekonstituiert.

Zusätzlich zu den beiden oben erwähnten Komponenten ist es bevorzugt, in dem Testkit Hilfsreagenzien vorzusehen, so daß alle notwendigen Erkennungsreagenzien und Kontroll reagenzien verfügbar sind. Für dieses Kit, bei dem HRPO als Markierung verwendet wird, ist es zweckdienlich, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat für das Enzym zu verwenden, und das TMB wurde in Tablettenform zur Verfügung gestellt, wobei jede Tablette ein ausreichendes Substrat für die 96 Kavitäten ergab. Unmittelbar vor der Verwendung werden die TMB-Tabletten in einer wäßrigen Lösung, welche tri-Natriumcitrat und Wasserstoffperoxid ent hält, gelöst. Es ist ebenfalls bevorzugt, positive und ne gative Kontrollseren vorzusehen. Das negative Kontrollserum ist normales humanes Serum, das für den Antikörper für CBL-1 bei diesem Test nicht reaktiv ist. Das positive Kon trollserum ist in der Wärme behandeltes Humanserum, welches für Antikörper für CBL-1 bei dem Testverfahren reaktiv ist. Zusätzlich ist es bevorzugt, ein verkürztes Kontrollserum, ein wärmebehandeltes Humanserum (das an den verkürzten Ge halt im Test) für Antikörper CBL-1 reaktiv ist, und eben falls eine Waschlösung, welche Salz und Tween 20 enthält, vorzusehen.

2. Verwendung des Testkits

Unmittelbar vor der Verwendung wird der HRPO-markierte Anti körper rekonstituiert. Der Versuch wird unter Verwendung von 25 Mikroliter Proben von Serum pro Kavität durch geführt. Zwei Kavitäten werden mit negativem Kontroll serum und eine mit positivem Kontrollserum beschickt, drei mit verkürztem Kontrollserum (der Ausdruck verkürzt bezieht sich auf den angelsächsischen Ausdruck "cut-off") und die Testproben werden in die verbleibenden Kavitäten gefüllt. 75 Mikroliter Teile des rekonstituierten HRPO-markierten Antikörpers werden in jede Kavität gegeben, und die Platte mit den Kavitäten wird dann bedeckt und auf einem Heizblock bei 45°C während 1 Stunde oder alternativ bei 20 bis 25°C über Nacht während mindestens 16 Stunden inkubiert. Gegen Ende der Inkubationszeit wird die Platte gewaschen, und 100 Mikroliter Teile der Substratlö sung werden zu jeder Kavität gegeben. Die Platte wird dann bei 20 Minuten bei 18 bis 25°C inkubiert. Danach ent wickelt sich eine blaue Farbe in den Kavitäten, die ne gative Proben enthalten. 50 Mikroliter Teile von 2M Schwe felsäure werden dann zu jeder Kavität gegeben, und die blaue Farbe ändert sich zu gelb. Die Absorption jeder Kavität bei 450 nm wird innerhalb von 30 Minuten nach der Zugabe von Schwefelsäure unter Verwendung eines Ablesegeräts für eine Mikrotiterplatte abgelesen.

3. Ergebnisse

Die Ergebnisse werden auf folgende Weise erhalten. Die mitt lere Absorption der drei verkürzten Kontrollsera wird be rechnet. Irgendeine Probe, die eine Absorption zeigt, wel che gleich oder größer ist wie die des mittleren verkürz ten Kontrollwerts, wird als negativer Antikörper für Aids- Retrovirus innerhalb der Grenzen des Testsystems angesehen. Irgendwelche Proben mit einer Absorption unterhalb von der mittleren verkürzten Vergleichsprobe oder bis zu 10% über der der mittleren verkürzten Vergleichsprobe wurden erneut geprüft.

Irgendwelche Seren, die wiederholt in diesem Test positive Ergebnisse gaben, wurden dann für Bestätigungszwecke unter Verwendung des Immunfluoreszenztests oder Western-Blotting tests erneut geprüft.

Das oben beschriebene Verfahren wurde mit 1600 Routine-Blut bank-Spenderproben mit negativen Ergebnissen getestet. Wur den jedoch andere klinische Proben von Patienten mit kli nischer Diagnose von Aids, einem Aids verwandten Komplex oder anderen Krankheiten getestet, so erhielt man positive Ergebnisse, und in praktisch jedem Fall erfolgte eine Be stätigung durch den Immunfluoreszenztest und durch einen anderen Enzymimmunoassay. Man erhielt die folgenden Ergeb nisse.

TABELLE

Reaktivität für Seren von Blutspendern und Patienten mit Aids, Aids assoziierten Zuständen und anderen Krankheiten

Das Prinzip der Verwendung eines humanen Antiserums für die Bindung von viralem Antigen an die feste Phase ergibt eine feste Phase, die selbst das Muster der viralen Antigene reflektiert. Dies wurde bei Menschen am besten erkannt. Dies kann von Vorteil sein, da hierbei ein gutes "Passen" zwischen dem Gemisch der eingefangenen Antigene und dem Profil der humanen Antikörper erhalten wird. Weiterhin können die milden Bedingungen, die zur Antigen- Herstellung verwendet wurden, die Konservierung delikater bzw. komplizierter, unförmiger Epitope erlauben, die in dem Gradienten der gereinigten und zerstörten Präparatio nen, welche bei anderen Festphasenassays verwendet werden, nicht vorhanden sind. Es ist jetzt möglich, das Gemisch aus Festphasen-Antigenen einzustellen, indem man die feste Phase mit monoklonalem Maus-Antikörper definierter Spe zifizität beschichtet, so daß die immobilisierten Antigene eine vorbestimmte Spezifizität aufweisen.

Die hier gezeigten Werte zeigen die überlegene Natur des Tests, wenn ein ausgewählter monoklonaler Antikörper,der mit p25 (einem 25 K Dalton Protein) reagiert, an der festen Phase verwendet wird. Die Vorteile liegen in der geringe ren Menge des Antigens, die für einen geeigneten Assay er forderlich ist (Tabelle A) und in der erhöhten Empfindlich keit des entstehenden Tests, vergleiche Tabelle B, wo ge zeigt wird, daß die Endpunktverdünnungen (d. h. niedrige OD-Ablesungen) der individuellen Seren eine höhere Inhibie rung bei den monoklonalen, verglichen mit den polyklonalen Tests ergeben. Die Erhöhung der Empfindlichkeit bewirkt, daß der Test wirksamer im Nachweis für Antikörperproduktion ist, verglichen mit vielen anderen Assays. Zusätzlich ver meidet die Verwendung von Maus-Antikörper an der festen Phase das potentielle Problem der rheumatoidartigen Fak toren-Kreuzvernetzung zwischen festem Phasen Human-IgG und Human-IgG-Konjugat in dem homologen Assay. Praktisch wurden wenige Sera identifiziert, welche konsistent einen größe ren Grad der Inhibierung bei dem Assay auf monoklonaler Grundlage zeigen, verglichen mit dem Assay auf polyklonaler Grundlage. Dieses Phänomen beruht wahrscheinlich auf dem geringen Gehalt und der niedrigen Titerreaktivität, welche Konjugate an die feste Phase in nicht spezifischer Weise nur in dem homologen Assay bindet. Dies oder ein ähnliches Phänomen kann ebenfalls eine weitere unerwartete Tatsache erklären, daß die Verteilung der optischen Dichtereaktivi tät der normalen Seren wesentlich enger in dem Assay auf monoklonaler Grundlage ist als bei dem gleichzeitig durch geführten polyklonalen Assay.

Da es sich als einfach erwiesen hat, einen monoklonalen Antikörper für ein retrovirales gag-Genprodukt zu verwen den, erhält man im wesentlichen einen Konkurrenzassay für die humane Anti-HTLV-III-Kernantwort, und es ist wahrschein lich, daß die Verwendung von Antikörper für definierte env- Produkte die Entwicklung analoger Assays für Antikörper für ausgewählte Envelope-Antigene erlaubt. Dies wird eine we sentlich genauere Untersuchung der humanen Antwort auf unterschiedliche Virus-Antigene erlauben, welches von Wich tigkeit bei klinischen, prognostischen und Infektions-Kon trolluntersuchungen sein kann.

TABELLE A

Titration von CEM/CBL-1-Antigen an polyklonalen und mono klonalen festen Phasen

TABELLE B

OD 450 nm Verdünnungen von 19 Sera, titriert auf 50% Inhi bierungs-Endpunkt, geprüft mit polyklonaler und monoklona ler fester Phase

In den obigen Beispielen wird der Assay durch Bestimmung der Markierung, die mit der festen Phase assoziiert ist, durchgeführt. Da jedoch auch der Markierungsgehalt, der mit dem Ausgangsserum assoziiert ist, bestimmt werden kann, ist es ebenfalls möglich, die Reduktion in der radioaktiven Zählung oder dem Enzymgehalt, der mit der flüssigen Phase assoziiert ist, nachdem ein bekanntes markiertes Serum und die Testseren in Kontakt mit dem Festphasen-Antigen ge bracht wurden, und die Verringerung in dem Gehalt der Mar kierung der flüssigen Phase, die als Maß für den Antikör pergehalt im Testserum verwendet wird, zu bestimmen.

Die Vorteile des gleichzeitigen Konkurrenzassays können unter den folgenden Überschriften zusammengefaßt werden.

Antigenherstellung

Obgleich in Beispiel 2 die Verwendung gereinigter HTLV-III- Viren beschrieben wird, erlaubt die verstärkte Bindung, die durch die Verwendung des immobilisierten Antikörpers kommt, die Verwendung einer rohen Zell-Lysatpräparation zum Be schichten, wenn sie alleine vorliegt, wobei ein solches An tigen nicht direkt auf irgendwelche nützliche Weise an eine feste Phase bindet. Diese Stufe entfernt die Beschränkung, daß hochgereinigtes Antigen für die Herstellung diagnosti scher Tests verwendet werden muß, und dadurch wird ihre Herstellung leichter. Dies ist ein Vorteil, welcher für die direkten Assays nicht anwendbar ist, wo eine gesamte humane Globulinbeschichtung ein nicht vermeidbares Signal mit der fertigen Anti-Human-Globulinmarkierung ergeben wür de.

Format bzw. Größe

Die Verwendung eines Volumens an nichtverdünntem Serum bie tet einen großen Vorteil für Bluttransfusionszentren, wo, wenn eine Anfangsverdünnung erforderlich wäre, die Arbeits belastung größer wäre. Das Verhältnis zwischen Serum und enzymmarkiertem Volumen kann innerhalb des Bereiches von 1 : 1 bis 1 : 10 mit nur geringer Änderung in dem Testergebnis variiert werden. Das Optimum beträgt 1 : 3, wobei 25 µl Serum und 75 µl Enzymmarkierung verwertet werden, und man erhält eine gute Differenzierung zwischen positiven und negativen Seren. Die Assayzeit kann auf 1 Stunde oder weniger unter Verwendung der ELISA-Technik verkürzt werden.

Empfindlichkeit

Ein Maß für die Empfindlichkeit irgendeines Assays für Aids- Antikörper wird durch das Verhältnis der Seren, die aus kranken Aids-Patienten im Endstadium entnommen werden müssen, welches positiv verbleibt, bestimmt. Bei direkten Assays scheint es so zu sein, daß eine unterschiedliche Zahl der Patienten ihre Antikörperreaktivität verlieren. Dies tritt nicht bei dem Konkurrenzassay auf, was nahelegt, daß die Empfindlichkeit des Konkurrenzassays so gut oder besser ist wie die eines der derzeit verwendeten Assays.

Spezifizität

Von einem Konkurrenzassay erwartet man nicht, daß große Probleme bei einer falschen positiven Reaktivität auftritt. Der Einschluß von Lymphozyten-Membran-Antigenen in den Envelope von HTLV-Virionen führt sicher zur falschen Reaktivität, wie die Anwesenheit von Aggregaten von IgG, welche nicht spezifisch an der festen Phase kleben. Ein solches Phänomen ergibt keine Erhöhung der Reaktivität bei dem Konkurrenz assay. Nichtspezifische Affekte variabler Proteinkonzentra tionen können durch Auswahl geeigneter Serum/Markierungs verhältnisse (1 : 3, wie oben) minimal gehalten werden und durch Verwendung der Verkürzung von über 50% Inhibierung. Sera, welche eine Inhibierung von Markierungsbindung gleich oder größer als das des inneren Kontrollserums ergeben, werden als Screen-Test positiv angesehen. Der Test sollte jedoch wiederholt werden. Aufgrund der niedrigen Werte für falsche Reaktivität, die auf unter 1 bei 5000 angenommen wird, ist es unwahrscheinlich, daß falsche positive Reak tionen bei dem Konkurrenz-ELISA numerisch große Schwierig keiten ergeben, wie dies bei anderen direkten Assays der Fall ist. Dies gilt insbesondere dort, wo die direkten Assays ohne Kontroll-Antigen durchgeführt werden. Man nimmt an, daß dies bei Transfusionszentren der Fall sein wird, da die Verwendung von Kontroll-Antigen die Erforder nisse für Reagenzien beim direkten Assay verdoppeln wür den.

Zusammenfassung

Die Kombination eines einfachen Formats, hoher Empfindlich keit und hoher Spezifizität bewirkt, daß der Konkurrenz assay ideal für das Screening von Blutspenden und für diag nostische Verwendung geeignet ist. Zusätzlich kann er dort, wo Zentren einen direkten Assay für Anti-HTLV-III verwen den, besser sein, um die Serumreaktivität zu bestimmen für die Retestung im Konkurrenzassay, anstatt daß man die Seren den arbeitsaufwendigeren und weniger empfindlichen Western- Blotting-Tests unterwirft, die von der FDA in den Vereinig ten Staaten empfohlen werden.

Claims

1. Verfahren für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper gegen Retroviren, bei dem man die biologische Probe

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das verwendete insolubilisierte Anti gen Antigene des humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1 um faßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß das verwendete insolubilisierte Anti gen Antigene der Retroviren humanes T-lymphotropes Retrovi rus HTLV-III, humanes T-leukämisches Retrovirus MTLV-TI oder humanes T-leukämisches Retrovirus HTLV-I umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Serum oder Plasma von humanem Blut ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß das verwendete Antigen Antigene der Retroviren humanes T-lymphotropes Retrovirus CBL-1 oder hu manes T-lymphotropes Retrovirus MTLV-III umfaßt, und daß das Immunglobulin, das mit dem Erkennungsmittel markiert ist, Immunglobulin von einem menschlichen Patienten ist, der asymptomatisch mit dem Aids-Retrovirus infiziert ist, aber einen normalen Immunglobulinspiegel aufweist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Erkennungs marker ein Enzymmarker ist.

7. Testkit, das

umfaßt.

8. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, daß das verwendete Antigen Antigene des humanen T- lymphotropen Virus CBL-1 umfaßt.

9. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, daß das verwendete insolubilisierte Antigen Antigene des humanen T-lymphotropen Virus MTLV-III, humanen T-leuk ämischen Virus MTLV-II oder humanen T-leukämischen Virus MTLV-I umfaßt.

10. Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, daß das verwendete insolubilisierte Antigen Antigene des humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1 oder humanen T-lym photropen Retrovirus MTLV-III umfaßt und daß das Immun globulin von einem humanen Patienten stammt, der asymptoma tisch mit dem Aids-Retrovirus infiziert ist, aber einen nor malen Immunglobulinspiegel aufweist.

11. Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch ge kennzeichnet, daß der Erkennungsmarker ein En zymmarker ist.

12. Verwendung von Antigenen des humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1, ätiologisch verwandt zu Aids, zum Nachweis von Antikörpern gegen Retroviren.

13. Leukämische T-Zellen CCRF-CEM, welche das humane T- lymphotrope Retrovirus CBL-1 beherbergen.

14. Insolubilisierte humane T-lymphotrope Retrovirus CBL- 1-Antigene, gebunden an Globulin oder an monoklonale Anti körper, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist.

15. Insolubilisierte Antigene nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Globulin aus einem hu manen Patienten stammt, der asymptomatisch bereits mit dem Aids-Retrovirus infiziert ist, aber einen normalen Immunglo bulinspiegel aufweist.

16. Insolubilisierte Antigene nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Globulin ein monoklo naler Antikörper ist, der Retrovirus-Antigen bindet.