DE10158523A1 - Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in Geweben - Google Patents
Hemmung der Transkription eines Zielgens in einer Zelle oder in GewebenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in Zellen oder Gewebe durch Infektion der Zellen oder des Gewebes mit Viruspartikeln.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Expression
eines Zielgens in eukaryontischen Zellen oder Gewebe. Sie umfasst außerdem eine
Zelle, in der die Hemmung der Expression eines Zielgens spezifisch ist, und schließ
lich betrifft sie ein Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Transkription eines Ziel
gens in einer Zelle enthält.
Die spezifische Hemmung der Genexpression ist für die therapeutische For
schung von enormer Bedeutung. Genauer gesagt könnte sie eingesetzt werden, um
eine Technik zu entwickeln, mit der spezifisch die Funktion einzelner Gene gehemmt
werden kann.
Insbesondere könnte sie verwendet werden, um die Progression spezifischer
Krankheiten zu verhindern, etwa bei Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten oder
neurologischen Störungen, indem z. B. die Funktion spezifischer Gene gehemmt wird.
Außerdem könnte sie eingesetzt werden, um die Unterschiede zwischen ei
nem normalen und einem erkrankten Gewebe analysieren zu können.
Ferner wäre sie von Vorteil für die Untersuchung der Zellproliferation, für die
Analyse der Genfunktion oder der funktionellen Veränderung der Genexpression.
Bestimmte Gene sind möglicherweise nur in bestimmten Entwicklungsstadien für die
Lebensfähigkeit einer Zelle oder eines Organismus erforderlich.
Klassische genetische Techniken wurden eingesetzt, um Mutationen in Orga
nismen mit einer verminderten Expression ausgewählter Gene zu charakterisieren.
Für solche Techniken sind aufwendige Absuchverfahren erforderlich, außerdem sind
sie auf Organismen beschränkt, bei denen sich die genetische Manipulation bereits
etabliert hat.
Diese Schwierigkeiten lassen sich mit einem Verfahren umgehen, bei dem die
Genexpression in Säugerzellen gehemmt wird, indem sie durch doppelsträngige (ds)-
RNA gestört wird.
Die Technik beruht auf dem Einführen von ds-RNAs in Zellen, wo es zu einer
Störung spezifischer messenger-RNA(mRNA)-Moleküle kommt, wodurch die Genex
pression gehemmt wird.
In der internationalen Patentanmeldung WO 99/32619 wird ein Verfahren be
schrieben, mit dem die Genexpression in einem wirbellosen Modellorganismus spe
zifisch gehemmt wird. Dieses Verfahren beruht auf der Verwendung von ds-RNAs
und deren Einführen in eine lebende Zelle, wodurch die Genexpression eines Ziel
gens in dieser Zelle gehemmt wird. Die ds-RNAs werden in die Zelle, d. h. intrazellu
lär, oder extrazellulär, d. h. in eine Körperhöhle, eingeführt.
In der internationalen Patentanmeldung WO 99/32619 kann ein in ein Virus
partikel verpacktes virales Konstrukt verwendet werden, um ein Expressionskonstrukt
in die Zelle einzuführen und die durch das Expressionskonstrukt codierte RNA wirk
sam zu transkribieren.
Konstrukte mit sowohl Sense- als auch Antisense-Sequenzen im gleichen vi
ralen Vektor bewirkten keine erfolgreiche Hemmung der Genexpression, was
höchstwahrscheinlich auf einer unzulänglichen Wechselwirkung mit der Ziel-mRNA
zurückzuführen ist. Es wurde postuliert, dass, wenn die Sense- und die Antisense-
RNA durch ein einziges Konstrukt codiert werden, die Bildung des RNA-
Doppelstrangs unmittelbar erfolgt und deshalb keine Wechselwirkung mit den
mRNAs möglich ist.
Kürzlich wurde in einer wissenschaftlichen Veröffentlichung (F. Wianny und M.
Zernicka-Goetz, "Specific interference with gene function by double stranded RNA in
early mouse development", Nature Cell Biology, Bd. 2, Februar 2000, S. 70-75) be
schrieben, dass synthetische ds-RNAs sowohl in Maus-Oocyten als auch Prä
implantations-Embryos mittels Mikroinjektion eingeführt wurden und eine spezifische
Hemmung der Genexpression bewirkten.
Eine Hauptschwierigkeit besteht zurzeit darin, die ds-RNA effizient in die Zel
len einzuführen. Auf diesem Gebiet wurde noch keine genetische Technik entwickelt,
mit der ds-RNAs direkt in Zellen eingeführt werden können.
Natürlich wäre es vorteilhaft, wenn ds-RNAs biologisch und nicht mechanisch
in Zellen eingeführt werden könnten. Ein solches Einführen würde die Manipulationen
reduzieren und verhindern, dass mechanische Zellschäden entstehen.
Außerdem wäre die Fähigkeit, ein spezifisches Zielgen hemmen zu können,
ohne andere Gene der Zelle zu beeinträchtigen, von großer Wichtigkeit.
Schließlich wäre es von wesentlichem Interesse, ein spezifisches Zielgen zu
einem spezifischen Zeitpunkt und an einer definierten Stelle in einem Gewebe oder
Organismus hemmen zu können, ohne dass permanente Mutationen in das Zielge
nom eingeführt werden müssen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Hemmung der Expression
eines Zielgens in Zellen oder Gewebe bereit, umfassend die Infektion der Zellen oder
des Gewebes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA)
enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzel
strängige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang
darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen ent
halten, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind. Die vorliegende Erfindung be
trifft außerdem eine Zelle, in der zwei komplementäre RNA-Stränge die Expression
eines Zielgens stören, sie betrifft ein Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Tran
skription eines Zielgens in Zellen oder Gewebe umfasst, und schließlich die Verwen
dung des beanspruchten Verfahrens für die Behandlung und Verhinderung einer
Krankheit sowie ein Arzneimittel.
Der hier verwendete Begriff "ds-RNA" bedeutet doppelsträngige RNA.
Der hier verwendete Begriff "ss-RNA" bedeutet einzelsträngige RNA.
Der hier verwendete Begriff "Sense" bedeutet eine RNA-Sequenz, die dem
Strang der mRNA entspricht.
Der hier verwendete Begriff "Antisense" bedeutet eine RNA-Sequenz, die zu
dem Sense-Strang der mRNA komplementär ist.
Der hier verwendete Ausdruck "eine Sequenz, die spezifisch ist für" bedeutet,
dass die Sequenz des Sense- und des Antisense-RNA-Strangs mit dem Zielgen in
mindestens 90%, vorzugsweise 95%, stärker bevorzugt 99% und am stärksten be
vorzugt 100% der Basen identisch ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Hemmung der Expression ei
nes Zielgens in Zellen oder Gewebe umfasst die Infektion der Zellen oder des Gewe
bes mit (a) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten,
die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ri
bonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei
der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu
einem Teil des Zielgens homolog sind.
Die vorliegende Erfindung kann für eine selektive Hemmung spezifischer
Genfunktionen eingesetzt werden, indem ds-RNAs in den Zellen biologisch erzeugt
werden, im Gegensatz dazu, dass ds-RNAs in die Zellen oder in das Gewebe me
chanisch eingeführt werden. Insbesondere kann sie zur Behandlung oder Verhinde
rung spezifischer Krankheiten oder pathologischer Befunde eingesetzt werden, wobei
eine spezifische Überexpression von Genen gehemmt wird, die für das Ausbrechen
oder die Fortdauer der Krankheiten oder der pathologischen Befunde erforderlich ist.
Eine Behandlung würde eine Besserung beliebiger Symptome, die bei der Krankheit
auftreten, oder klinischer Indikationen umfassen, die mit den pathologischen Befun
den assoziiert sind.
Z. B. kann die vorliegende Erfindung zur Behandlung oder zur Vorbeugung bei
Patienten eingesetzt werden, die an Tumoren leiden, indem eine spezifische Gen
funktion gehemmt wird. Tumoren umfassen Krebserkrankungen des Ovars, der Pro
stata, der Brust, des Colons, der Leber, des Magens, des Gehirns, von Kopf und
Hals sowie der Lungen.
Eine weitere Verwendung der vorliegenden Erfindung könnte ein Verfahren
darstellen, mit dem eine Genfunktion in einem Organismus durch eine spezifische
Hemmung der Expression identifiziert wird.
Außerdem kann die vorliegende Erfindung für die Analyse und Verhinderung
des Mechanismus für Wachstum, Entwicklung, Stoffwechsel, Widerstandsfähigkeit
gegenüber einer Krankheit oder andere biologische Prozesse eingesetzt werden.
Der vorliegende Erfindung weist die folgenden Vorteile auf: die Einfachheit
einer biologischen Erzeugung von ds-RNAs in Zellen oder Gewebe, die hocheffizi
ente Amplifikation der eingeführten ss-RNAs, die Stabilität von ds-RNAs in Zellen
und Gewebe und die Wirksamkeit der Hemmung sowie die biologische Sicherheit.
Der Begriff "Alphavirus" hat seine herkömmliche Bedeutung nach dem Stand
der Technik und umfasst die verschiedenen Arten von Alphaviren, wie Eastern Equi
ne Encephalitis-Virus (EEE), Venezuelan Equine Encephalitis-Virus (VEE), Evergla
des-Virus, Mucambo-Virus, Pixung-Virus, Western Equine Encephalitis-Virus (WEE),
Sindbis-Virus, South African Arbovirus Nr. 86, Semliki Forest-Virus, Middelburg-
Virus, Chikungunya-Virus, O'nyong-nyong-Virus, Ross River-Virus, Barmah Forest-
Virus, Getah-Virus, Sagiyama-Virus, Bebaru-Virus, Mayaro-Virus, Una-Virus, Aura-
Virus, Whataroa-Virus, Babanki-Virus, Kyzylagach-Virus, Highlands J-Virus, Fort
Morgan-Virus, Ndumu-Virus und Buggy Creek-Virus. Der Begriff "Alphavirus" umfasst
auch Vektoren, die davon hergeleitet sind. Bevorzugte Alphaviren umfassen z. B. das
Semliki Forest-Virus (SFV) (Liljeström und Garoff, 1991, "A new generation of animal
cell expression vectors based on the Semliki Forest virus replicon", Bio/Technology
9, 1356-1361), Sindbis-Virus (SIN) (Xiong et al., "Sindbis virus: An efficient broad
host range vector for gene expression in animal cells", Science 243 (1989), 1188-
1191) und Venezuelan Equine Encephalitis-Virus (VEE) (Davis et al., "In vitro syn
thesis of infectious venezuelan equine encephalitis virus RNA from a cDNA clone:
Analysis of a viable deletion mutant", Virology 171 (1989), 189-204). Das Alphavirus
und davon hergeleitete Vektoren sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhält
lich.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die Zellen oder das Ge
webe mit einer Menge von Viruspartikeln, die ss-RNA enthalten, infiziert, so dass
mindestens eine Kopie pro Zelle übertragen werden kann. Wie hier beschrieben wird
die Infektion mit einer Anzahl durchgeführt, die größer oder gleich zehn Viruspartikeln
pro Zelle entspricht.
Das Infektionsverfahren ist dem Fachmann bekannt. Die in vitro-Infektion von
Zell-Linien und primären Zellkulturen, wie z. B. Fibroblasten, Hepatocyten, Neuronen,
erfolgt, indem SFV-Partikel direkt zu den Zellkulturen zugegeben werden. Die Viru
spartikel erkennen Rezeptoren auf der Zelloberfläche, durchdringen die Zellmembran
entweder durch Fusion oder durch Endocytose (abhängig vom Zelltyp), wonach die
RNA-Moleküle ins Cytoplasma freigesetzt werden ("The Alphaviruses: Gene Expres
sion, Replication and Evolution", Strauss, J. H., und Strauss, E. G., Microbiological
Reviews 58 (1994), 491-562).
Für eine in vivo-Infektion ist die Injektion der SFV-Partikel ins Zielgewebe er
forderlich. Eine Injektion von SFV-Partikeln ("Efficient in vivo expression of a reporter
gene in rat brain after injection of recombinant replication-deficient Semliki Forest
virus", Lundstrom, K., Grayson, J. R., Pink, J. R., und Jenek, F., Gene Therapy &
Molecular Biology 3 (1999), 15-23) führt zu einer ähnlichen Infektionsprozedur wie
vorstehend für die in vitro-Situation beschrieben.
Zellen oder Gewebe werden im vorstehenden Verfahren mit separaten Viru
spartikeln infiziert, die komplementäre Stränge, Sense- und Antisense-RNA-Stränge
exprimieren.
Wie hier beschrieben können Zellen oder Gewebe im vorliegenden Verfahren
mit gleichen Mengen von Viruspartikeln, die den Sense-RNA-Strang enthalten, und
von Viruspartikeln, die den Antisense-RNA-Strang enthalten, gemeinsam infiziert
werden, wodurch die Bildung von ds-RNAs ermöglicht wird, die in der Lage sind, die
Genexpression zu stören. Durch höhere Dosen von ds-RNA kann möglicherweise
eine stärkere Hemmung bewirkt werden.
In der vorliegenden Erfindung enthalten die Viruspartikel den ss-RNA-Strang,
der Nucleotidsequenzen umfasst, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind, und
dieser ss-RNA-Strang wird in den Vektor des Alphavirus cloniert. Der ss-mRNA-
Strang kann entweder in Sense- oder in Antisense-Orientierung in den Vektor cloniert
werden. Die anderen Gene, die im Vektor vorliegen, sind die Nicht-Strukturgene des
Alphavirus, insbesondere die Gene nsP-1-4 ("The Alphaviruses: Gene Expression,
Replication, and Evolution", Strauss, J. H., und Strauss, E. G., Microbiological Re
views 58 (1994), 491-562), die für die RNA-Replikation in Wirtszellen verantwortlich
sind. Dis Expression von nsP-1-4 führt zur Bildung des Replicase-Komplexes, der
eine intensive RNA-Replikation in Gang setzt, d. h. die Erzeugung großer Mengen
von Sense- und Antisense-RNA, die zu einer effizienten Bildung von ds-RNA in der
Lage sind.
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht allgemein die Hemmung vieler
verschiedener Arten von Zielgenen in eukaryontischen Zellen oder Gewebe. Das
Zielgen kann ein eukaryontisches Gen, ein Virusgen, ein Gen eines Krankheitserre
gers oder ein synthetisches Gen sein. Natürlich kann das Zielgen ein aus der Zelle
stammendes Gen, d. h. ein zelluläres Gen, ein Transgen, d. h. ein Genkonstrukt, das
an einer ektopischen Stelle im Genom der Zelle eingefügt ist, oder ein Gen aus ei
nem Krankheitserreger sein, der einen Organismus infizieren kann, aus dem die
Zelle stammt.
Die Zielgene können ein beliebiges Gen von Interesse sein, wobei bereits eine
große Zahl von Proteinen von Interesse identifiziert und isoliert wurde. Das Zielgen
kann z. B. ein die Entwicklung betreffendes Gen, wie Cyclinkinase-Inhibitoren,
Wachstums-/Differenxierungs-Faktoren und ihre Rezeptoren, Telomerase-Reverse-
Transkriptase (TERT), ein Onkogen, ein Tumorsuppressor-Gen oder ein Enzym sein.
Ein von einem beliebigen Krankheitserreger stammendes Gen kann das Ziel der
Hemmung sein.
Da die Hemmung der vorliegenden Erfindung sequenzspezifisch ist, umfassen
die in die Zellen oder ins Gewebe eingeführten Sense- und Antisense-RNA-Stränge
eine komplementäre Nucleotidsequenz eines Teils des Zielgens.
Zum Durchführen der vorliegenden Erfindung ist es nicht erforderlich, dass
eine vollständige Homologie zwischen der RNA und dem Zielgen vorliegt. Wie hier
beschrieben werden Sequenzvariationen toleriert, die z. B. auf genetischen Mutatio
nen, Polymorphismen oder evolutionären Abweichungen beruhen. Es wurde gefun
den, dass RNA-Stränge für Hemmungen wirksam sind, die im Vergleich zum Zielgen
Insertionen, Deletionen und einzelne Punktmutationen aufweisen.
Die Länge der homologen Nucleotidsequenz sollte mindestens 50 Basen, vor
zugsweise 75, 100 oder 125 Basen ausmachen.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung äußert sich die Hemmung der
Expression des Zielgens durch einen phänotypischen Verlust. Abhängig vom Zielgen
und der intrazellulären Dosis der ds-RNA kann das Verfahren der vorliegenden Erfin
dung zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Funktion des Zielgens in den
Zellen oder im Gewebe des Organismus führen.
Die Hemmung der Genexpression bezieht sich auf das Fehlen oder die Ab
nahme des Spiegels des Proteins und/oder der mRNA aus dem Zielgen. Die Folgen
der Hemmung auf Eigenschaften der Zelle oder des Organismus können durch Ver
fahren der Molekularbiologie getestet werden, wie z. B. RNA-Lösung-Hybridisierung,
Northern-Hybridisierung (Sambrook et al., Molecular Cloning, Bd. 1, 7. 37 und 7.39)
und biochemische Tests, wie z. B. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA),
Western Blotting (Towbin et al., 1979; Bunette, 1981, oder Sambrook et al., Molecu
lar Cloning, Bd. 3, 18.60) oder Radioimmuntest (RIA) (Sambrook et al., Molecular
Cloning, Bd. 3, 18.19-18-20).
Das Ausmaß der Hemmung kann bestimmt werden, indem die Werte aus un
behandelten Zellen mit denen verglichen werden, die aus Zellen erhalten wurden, die
gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt wurden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine beliebige Zelle, die zwei komple
mentäre RNA-Stränge, einen Sense- und einen Antisense-RNA-Strang, enthält, die
innerhalb der Zeile eine doppelsträngige RNA bilden, und die aufgrund der Homolo
gie der Nucleotidsequenz mit einem Teil eines spezifischen Zielgens in der Lage
sind, die Expression des Zielgens zu stören.
Wie hier beschrieben können die eukaryontischen Zellen oder das Gewebe
mit dem Zielgen einen beliebigen Zell- oder Gewebetyp darstellen, der mit einem Al
phavirus infiziert werden kann. Sie können z. B. aus dem vaskulären oder extravas
kulären Kreislauf, aus dem Blut- oder Lymphsystem, aus Muskeln, Leber, Gehirn
oder aus der Zerebrospinalflüssigkeit stammen.
Die eukaryotischen Zellen oder das Gewebe können in einem beliebigen Or
ganismus enthalten sein, einschließlich z. B. Fisch, Amphibien, Reptilien, Insekten
oder Säuger, wie Rind, Schwein, Hamster, Maus, Ratte, Primat und Mensch.
Außerdem beansprucht die vorliegende Erfindung ein Kit, das Reagenzien zur
Hemmung der Expression eines Zielgens umfasst, wobei das Kit mindestens eine
ausreichende Menge von einzelsträngigen viralen RNA-Partikeln enthält, die entwe
der den Sense- oder den Antisense-RNA-Strang darstellen, die zueinander komple
mentär sind und eine ds-RNA bilden, umfassend eine Nucleotidsequenz, die zu ei
nem Teil des Zielgens homolog ist, und die in der Lage sind, die Expression des
Zielgens zu stören.
Ein solches Kit kann Reagenzien umfassen, die erforderlich sind, um die RNA
in vivo oder in vitro in die Testproben oder Individuen einzuführen.
Ein solches Kit kann auch Anweisungen enthalten, anhand dessen ein An
wender des Kits die Erfindung durchführen kann.
Die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird auch für die
Behandlung oder Verhinderung einer Krankheit beansprucht.
Zur Behandlung einer Krankheit oder eines pathologischen Befunds kann ein
Zielgen ausgewählt werden, das während der Entwicklung der Krankheit exprimiert
wird oder das die Ursache des pathologischen Befunds ist.
Zur Verhinderung einer Krankheit oder eines pathologischen Befunds kann ein
Zielgen ausgewählt werden, das für das Ausbrechen und/oder die Fortdauer der
Krankheit oder des pathologischen Befunds erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung kann für die Behandlung oder Verhinderung von
Krebs eingesetzt werden, einschließlich solider Tumoren oder Leukämien, indem
Tumoren mit den viralen Vektoren, die Sense- und Antisense-RNA enthalten, ge
meinsam infiziert werden, mit dem Ziel, ds-RNA für die Hemmung der mRNA-
Transfation eines Gens zu erzeugen, das für die Fortdauer des karzinogenen/tumori
genen Phänotyps erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung kann z. B. für die Behandlung oder Verhinderung
von Infektionskrankheiten eingesetzt werden, die auf einen Krankheitserreger zu
rückzuführen sind. Zellen oder Gewebe, die/das mit dem menschlichen Immundefizi
enzvirus (HIV) infiziert sind/ist oder die/das damit infiziert werden können/kann, kön
nen/kann gemäß der vorliegenden Erfindung als Ziel dienen, um die Expression ei
nes spezifischen Gens zu hemmen, das für das Ausbrechen und/oder die Fortdauer
der Infektion verantwortlich oder dafür erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von (a) Viruspartikeln,
die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-
Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-
RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der
Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil eines Ziel
gens homolog sind, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krank
heiten.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Viruspartikel, die (a) einzelsträn
gige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt,
und Viruspartikel, die (b) einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die
einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-
Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil eines Zielgens homolog
sind, zur Verwendung als eine therapeutisch wirksame Substanz zur Behandlung
oder Verhinderung einer Krankheit, insbesondere als Anti-Krebs-Substanz.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, umfassend (a)
Viruspartikel, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen
Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikel, die einzelsträngige Ribonuclein
säure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sen
se- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen umfassen, die zu einem Teil
eines Zielgens homolog sind, und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Exci
pienten, für die Hemmung der Expression des Zielgens in Zellen oder Gewebe.
Die vorliegende Erfindung läßt sich anhand der folgenden Beispiele besser
verstehen, wobei diese lediglich der Erläuterung dienen und die Erfindung in keiner
Weise einschränken sollen.
Die nachstehenden Beispiele werden zusammen mit den folgenden Figuren
präsentiert.
Abbildung A: Schematische Darstellung des menschlichen Aldolase-A-Gens
und von Sonden, die für die Expressionsanalyse verwendet wurden. A und B sind
Fragmente, die als Sonde zum Testen von Northern-Blots eingesetzt wurden (Fig.
2). V und G sind Primerpaare, die entweder die durch die Virus-Stammpräparate
dargestellte RNA oder andere selektiv chromosomale Transkripte amplifizieren.
Abbildung B: Nachweis von entweder viral codierter Aldolase-mRNA mit
VAIVB (die ersten zwei Darstellungen von oben) oder von endogen codierter mRNA
unter Verwendung von GA/GB (die unteren Darstellungen). Co sind nicht-infizierte
Kontrollzellen, s ist mit dem Sense-Strang-Virus und as mit dem Antisense-Virus infi
ziert, und ds stellt ein 1 : 1-Gemisch aus beiden Virus-Stammpräparaten dar (Block-
Stammpräparat).
Obere Abbildung: Die Gesamt-RNA von infizierten Zellen (vgl. Fig. 1) wurde durch
Gelanalyse aufgetrennt, auf eine Membran überführt und entweder mit der markier
ten Sonde A, die die durch das Virus dargestellte Region abdeckt, oder mit der Son
de B getestet, die für chromosomale Kopien von Aldolase-A-RNA spezifisch ist. Für
die Sonde A war eine Exposition von 1,5 Stunden und für die Sonde B eine Über
nacht-Exposition auf Röntgenfilm erforderlich. Unten ist ein gescanntes Diagramm
der Autoradiographie des Sonde-B-Blots dargestellt.
Die Zellen wurden mit einer MOI (Infektions-Multiplizität) von 0,5 bis 50 mit
s/as-Virus-Block-Stammpräparaten infiziert und 24 Stunden inkubiert. Die Gesamt-
RNA wurde isoliert und in cDNA überführt. Eine PCR wurde 25 Zyklen lang mit Pri
mern durchgeführt, die entweder für Aldolase oder für GAPDH (Kontrolle) spezifisch
waren. Die Amplicons wurden durch herkömmliche Agarose-Gelelektrophorese
sichtbar gemacht. Die Ergebnisse mit zwei unabhängigen Virus-Block-Stammprä
paraten sind dargestellt (1/3 und 4/5).
HEK-Zellen (menschliche embryonale Nierenzellen) wurden mit 1/3 Block-Stammprä
paraten oder mit den einzelnen s- und as-Stammpräparaten infiziert. Die Zellen wur
den die angegebenen Zeiten inkubiert, worauf eine PCR-Analyse der Transkriptebe
nen folgte
Co bedeutet den Enzymwert in nicht-infizierten Zellen, und B stellt einen Puffer
als negative Kontrolle dar, as-, s- und Block-Stammpräparate (ds) wurden zur 24-
stündigen Infektion von Zellen bei einer MOI von 25 eingesetzt. Die Zellen wurden
geerntet, lysiert und die Enzymaktivität unter Verwendung eines kommerziellen Tests
anhand von 3 oder 5 µl Lysat gemessen.
Von links nach rechts: 1 Kontrolle Medium; 2 nicht-infizierte Zellen (maxi
male Proliferation); 3 Zellen, die mit einem Virus infiziert waren, das das grüne fluo
reszierende Protein (GFP) exprimierte (Kontrolle der Infektion); 4 und 5 Kontrolle
des Tests mit den Antibiotika G418 und Zeocin; 6 ds-RNA der menschlichen Aldo
lase A (Kontrolle der Hemmung); 7 Cyclin A-Sense-SFV; 8 Cyclin A-Antisense
SFV; 9 Cyclin A-Sense- und Antisense-SFV (ds); 10 Cyclin B-Sense-SFV; 11
Cyclin B-Antisense-SFV; 12 Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV (ds); 13 Cyclin A-
Sense- und Cyclin B-Sense- und Antisense-SFV (ds).
Die in den nachstehenden Beispielen erforderlichen Verfahren und Techniken
sind aus der Literatur bekannt und werden z. B. in Sambrook et al., 1989, beschrie
ben.
In den nachstehenden Beispielen ist der verwendete SFV-Vektor eine nicht
cytopathogene Version mit zwei Punktmutationen im SFV-Nicht-Strukturgen nsP2
(Ser259Pro und Arg650Asp), beschrieben von Lundstrom, K., Schweitzer, C., Ri
chards, J. G., Ehrengruber, M. U., Jenck, F., und Muelhardt, C., 1999, "Semliki Fo
rest virus vectors for in vitro und in vivo applications", Gene Therapy and Molecular
Biology 4 (1999), 23-31. Dieser modifizierte SFV-Vektor bewirkt in den infizierten
Wirtszellen keine Hemmung der endogenen Genexpression, so dass eine gezielte
und spezifische Genhemmung durch die ds-RNA-Technologie möglich ist.
Auf Grundlage des menschlichen Aldolase-A-Gens (M. Sakakibara, T. Mukai
und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messen
ger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420) wurden
drei Paare von Oligonucleotid-Primern ausgewählt, um die erforderlichen Genregio
nen zu amplifizieren. VA (Nt. 210 bis 240, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K.
Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA
in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) und
VB (Nt. 740 bis 710, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide se
quence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the liver", Bio
chem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben) amplifizieren eine
Region von etwa 600 Nucleotiden, die für die Konstruktion der Sense- und Antisen
se-Virus-Stammpräparate verwendet wurde. GA (Nt. 170 bis 200, wie von M. Saka
kibara, T. Mukai und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human al
dolase: A messenger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985),
413-420, beschrieben) und GB (Nt. 780 bis 750, wie von M. Sakakibara, T. Mukai
und K. Hori, "Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messen
ger RNA in the liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, be
schrieben) amplifizieren eine chromosomale Region des Aldolase-Gens. Die Nor
thern-Sonde A wird unter Verwendung der Primer VA und VB hergestellt, und die
Sonde B wird mit einem Primerpaar der Stromaufwärts-Region amplifiziert (Nt. 951
bis 980 und Nt. 1330 bis 1301, wie von M. Sakakibara, T. Mukai und K. Hori,
"Nucleotide sequence of a cDNA clone for human aldolase: A messenger RNA in the
liver", Biochem. Biophys. Res. Commun. 30 (1985), 413-420, beschrieben). Die Zel
len wurden infiziert und 24 Stunden gezüchtet. Die RNA wurde isoliert und gemäß
herkömmlichen Verfahren in cDNA überführt. Alle PCR-Produkte wurden für die Se
quenzierung in herkömmliche Clonierungsvektoren subcloniert. VA/VB wurde weiter
in den SFV-Vektor cloniert, um infektiöse SFV-Partikel zu erzeugen. Die viral codierte
Aldolase-mRNA ist reichlich vorhanden und lässt sich nach 15 PCR-Zyklen in Virus
infizierten Zellen nachweisen. In Zellen ohne Virus wird kein Signal erhalten. Unter
Verwendung der genomischen Primer für Aldolase-mRNA wird eine Bande der er
warteten Größe in den nicht-infizierten Zellen und in Zellen, die mit Sense- oder Anti
sense-produzierenden Viren infiziert waren, nachgewiesen. Das Gemisch aus sowohl
Sense- als auch Antisense-Viren ist eine wirksamer Inhibitor der Expression des
chromosomalen Aldolase-Gens, während die Expression der viralen Gene unbeein
flusst bleibt.
Die Gesamt-RNA aus nicht-infizierten Zellen oder aus Zellen, die mit den an
gegebenen Virus-Stammpräparaten infiziert waren, wurde auf einem herkömmlichen
Formamid-Gel aufgetrennt, nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulose-Mem
bran überführt und anschließend entweder mit dem radiomarkierten Fragment A oder
B als Sonde getestet (vgl. Beispiel 1). Die Sonde A weist aufgrund der kurzen Expo
sitionszeit von 45 Minuten fast ausschließlich die aus dem Virus stammende Aldola
se-RNA nach. Die Sonde B weist nach 16 Stunden Exposition des .hybridisierten
Blots mit dem Film lediglich chromosomal codierte Aldolase-mRNA nach. Ein ge
färbtes Gel mit ribosomaler RNA wurde verwendet, um das Auftragen zu kontrollieren
(unter der Sonde B). Insbesondere aus dem gescannten Diagramm des Gels ist
deutlich ersichtlich, dass die Spiegel der Aldolase-mRNA in den Zellen am niedrig
sten sind, die mit beiden Viren infiziert sind.
Wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, beginnen die Spiegel der Aldolase-mRNA im
Vergleich zur Kontrolle bei einer MOI von 12,5 abzunehmen, und bei 50 kann unter
Verwendung dieses empfindlichen Tests im wesentlichen keine mRNA nachgewie
sen werden. Dagegen werden die Spiegel eines anderen chromosomalen Kontroll
gens (GAPDH) mit steigender MOI nicht verändert.
BHK-Zellen (registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) wurden mit as- oder s- oder
einem as/s-Gemisch von Aldofase-RNA-Virus-Stammpräparaten infiziert. Zu den in
der Figur angegebenen Zeitpunkten wurde die RNA isoliert und in cDNA überführt.
Nach der PCR wurden die Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert.
Nach acht Stunden zeigt sich eine geringfügige Zerstörung der genomischen Aldola
se-RNA, und die höchste Aktivität lässt sich nach 48 Stunden nachweisen. In diesem
bestimmten Experiment beeinflusste auch das Sense-darstellende Virus die Stabilität
der RNA. Die GAPDH-RNA bleibt unverändert, außer in den 48- und 72-Stunden-
Proben, in denen eine Verringerung der RNA-Spiegel in den Zellen deutlich wird, die
mit dem s/as-Virus-Gemisch infiziert waren. Dies hängt möglicherweise mit dem Ab
sterben der Zellen zusammen, da es sich bei der Aldolase um ein essentielles En
zym handelt.
BHK-Zellen (registrierte ATCC-Nummer: CCL-10) wurden mit den angegebe
nen Stammpräparaten infiziert und 24 Stunden unter herkömmlichen Bedingungen
für die Zellkultur gezüchtet. Die Zellen wurden geerntet und in 1 × PBS, enthaltend
0,2% Triton X-100, lysiert. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 16 000 × g und bei
4°C wurde der Überstand gewonnen und entweder 3 µl (graue Balken) oder 5 µl
(schwarze Balken) anhand eines kommerziellen Kits (SIGMA, Katalog-Nr. 752-A)
und des gelieferten Protokolls getestet. Die deutlichste Verringerung der Enzymakti
vität tritt wie erwartet in der Probe auf, die mit den beiden s- und as-Virus-
Stammpräparaten infiziert war.
Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293-Zellen) (registrierte ATCC-Nummer:
CRL-1573) wurden zum Zeitpunkt Null mit den angegebenen SFV-Viruspartikeln infi
ziert und die Proliferation nach 20 (hellgraue Balken) und 40 Stunden (dunkelgraue
Balken) in Kultur unter Verwendung eines kommerziellen Farbtests getestet (Prome
ga G5421 gemäß dem technischen Merkblatt TB245). Das Gemisch der Cyclin A-
und B-blockierenden Viruspräparate war am effektivsten und sogar noch wirksamer
als die Hemmung des Zellwachstums durch Antibiotika (Neomycin und Zeocin).
Die Sequenz von Cyclin A ist wie beschrieben ("Hepatitis B virus integration in
a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma", Wang, Chevenisse X., Henglein, B.,
Brechot, C., Nature 343 (1990), 555-557), und die Sequenz von Cyclin B ist wie be
schrieben (Kim, D. G., Choi, S. S., Kang, Y. S., Lee, K. H., Kim, U.-J., Shin, H.-S.,
eingereicht (6. Mai 1997) bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken, Hinterle
gungsnummer AF002822, Life Science, Pohang University of Science and Technolo
gy, San 31, Pohang, Kyungbuk 790-784, Korea).
Sense- und Antisense-Fragmente der Cyclin A- und B-Gene wurden in einen
einzelnen SFV-Vektor cloniert, indem ein zweiter subgenomischer 26S-Promotor
eingeführt wurde. Die Konstrukte waren wie folgt:
SFV 26S - Sense-Cyclin A - SFV 26S - Antisense-Cyclin A und
SFV 26S - Sense-Cyclin B - SFV 26S - Antisense-Cyclin B.
SFV 26S - Sense-Cyclin A - SFV 26S - Antisense-Cyclin A und
SFV 26S - Sense-Cyclin B - SFV 26S - Antisense-Cyclin B.
Infektionen von HEK293-Zellen mit SFV-Cyclin A oder SFV-Cyclin B alleine
oder mit beiden zusammen bewirkten keinerlei Anhalten der Zellproliferation.
Dies zeigte, dass Konstrukte mit sowohl Sense- als auch Antisense-
Fragmenten im gleichen Vektor nicht in der Lage sind, die Expression chromosoma
ler Cyclin-Gene zu hemmen.
Claims (13)
1. Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in Zellen oder Gewe
be, umfassend die Infektion der Zellen oder des Gewebes mit (a) Virusparti
keln, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Sen
se-RNA-Strang darstellt, und (b) Viruspartikeln, die einzelsträngige Ribo
nucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang darstellt,
wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen ent
halten, die zu einem Teil des Zielgens homolog sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Viruspartikel Alphaviren sind.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei für die Infektion die Viruspar
tikel, die ss-RNA enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, in gleichen
Mengen vorliegen wie diejenigen, die ss-RNA enthalten, die einen Antisense-
RNA-Strang darstellt.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei einzelsträngige RNA entweder
in Sense- oder in Antisense-Orientierung in den Vektor des Viruspartikels clo
niert wird.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei das Zielgen ein eukaryonti
sches Gen, ein virales Gen oder ein synthetisches Gen ist.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei das Zielgen ein die Entwick
lung betreffendes Gen, ein Onkogen, ein Tumorsuppressor-Gen oder ein ein
Enzym codierendes Gen ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei die homologe Nucleotidse
quenz für das Zielgen spezifisch ist und eine Länge von mindestens 50 Basen
aufweist.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei die Zellen oder das Gewebe in
einem Organismus vorliegen und die Hemmung der Expression des Zielgens
sich durch einen phänotypischen Funktionsverlust äußert.
9. Kit, das Reagenzien zur Hemmung der Expression eines Zielgens in Zellen
oder Gewebe umfasst, wobei das Kit mindestens eine ausreichende Menge
von Viruspartikeln mit einzelsträngiger RNA (ss-RNA) enthält, die entweder ei
nen Sense- oder einen Antisense-RNA-Strang darstellt, die komplementär
sind und innerhalb der Zellen oder des Gewebes eine ds-RNA bilden, umfas
send eine Nucleotidsequenz, die zu einem Teil des Zielgens homolog ist, und
die in der Lage ist, die Expression des Zielgens zu stören.
10. Arzneimittel, umfassend (a) Viruspartikel, die einzelsträngige Ribonucleinsäure
(ss-RNA) enthalten, die einen Sense-RNA-Strang darstellt, und (b) Virus
partikel, die einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen
Antisense-RNA-Strang darstellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-
Strang Nucleotidsequenzen enthalten, die zu einem Teil eines Zielgens ho
molog sind, und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Excipienten.
11. Arzneimittel nach Anspruch 10 zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs,
vorzugsweise von soliden Tumoren oder Leukämien.
12. Viruspartikel, die (a) einzelsträngige Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die
einen Sense-RNA-Strang darstellt, und Viruspartikel, die (b) einzelsträngige
Ribonucleinsäure (ss-RNA) enthalten, die einen Antisense-RNA-Strang dar
stellt, wobei der Sense- und der Antisense-RNA-Strang Nucleotidsequenzen
umfassen, die zu einem Teil eines Zielgens homolog sind, zur Verwendung als
therapeutisch wirksame Substanz zur Behandlung oder Verhinderung einer
Krankheit.
13. Viruspartikel nach Anspruch 12 zur Verwendung als therapeutisch wirksame
Substanz, insbesondere als Anti-Krebs-Substanz.
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